MCM5在膀胱腫瘤組織和尿脫落細胞中的表達及臨床意義

曹冉華，云 升，蘇烏云，劉彩霞，趙海燕

（內蒙古醫科大學第一附屬醫院，內蒙古呼和浩特010050）

MCM5在膀胱腫瘤組織和尿脫落細胞中的表達及臨床意義

曹冉華，云 升，蘇烏云，劉彩霞，趙海燕

（內蒙古醫科大學第一附屬醫院，內蒙古呼和浩特010050）

目的 探討微小染色體維持蛋白（MCM）在膀胱腫瘤組織和尿脫落細胞中的表達及臨床意義。方法 收集本院2012年8月—2013年8月住院患者及健康志愿者的尿脫落細胞或膀胱組織標本，對其進行MCM5檢測。結果①膀胱癌患者在不同病理分級、臨床分期MCM／β－actin的差異有統計學意義（P＜0.05）；②80例膀胱癌患者尿脫落細胞中有71例MCM5呈陽性表達，與正常對照組和其他泌尿系疾病組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），膀胱癌患者尿脫落細胞MCM5陽性率在各病理分級、臨床分期差異無統計學意義（P均＞0.05），但其表達在各病理分級、臨床分期差異有統計學意義（P均＜0.05）。③與尿細胞學相比，尿脫落細胞MCM5檢測診斷膀胱癌的靈敏度、陰性預測值較高，假陰性率低，差異有統計學意義（P＜0.05），二者的特異度、假陽性率及陽性預測值比較差異無統計學意義（P＞0.05）。結論 尿脫落細胞中MCM5檢測對膀胱癌診斷意義重大，是對膀胱腫瘤復發檢測、預后評價較好的指標，值得廣泛應用于臨床診斷。

MCM5；膀胱腫瘤；尿脫落細胞；診斷

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0927）

膀胱腫瘤是最常見的泌尿系腫瘤，其惡性程度強、復發率高，且預后差，嚴重地影響患者的生活質量，甚至威脅著患者的生命安全。對膀胱腫瘤的早期發現、早期診斷是防治本病的關鍵［1］。許多研究發現，微小染色體維持蛋白（minichromosome maintenance proteins，MCM）可作為腫瘤標志物應用于疾病檢測，為此，我們對MCM5在膀胱腫瘤組織和尿脫落細胞中的表達及臨床意義進行探討，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源

尿脫落細胞和膀胱組織標本采自我院2012年8月—2013年8月住院的經術后病理證實為膀胱移行細胞癌患者80例（膀胱癌組），男性48例，女性32例，年齡28－76歲；病理分級：G1 35例，G2 24例，G3 21例；臨床分期：Tis－T1 34例，T2－T4 46例；其他泌尿系統疾病患者50例（泌尿系疾病組），男28例，女22例，年齡17－79歲；疾病類型包括尿路感染13例，泌尿系結石15例，輸尿管狹窄16例，前列腺增生6例；隨機選取20例健康志愿者作為對照組，男12例，女8例，年齡20－75歲。

1.2 標本收集及處理

取術前清晨第2次尿液至少150ml，從中分出1份50ml行尿細胞學檢查，剩余尿液做總RNA提取，置于4℃環境下，1 000r／min離心10min后棄上清液，將沉淀物用生理鹽水清洗2遍后立即提取。80例膀胱癌患者均留存腫瘤組織標本，并及時置于－80℃冰箱內保存。

1.3 試劑

選用美國Invitrogen公司生產的Trizol試劑，美國Promega公司生產的TaqDNA聚合酶、dNTPs、Reverse Transcription System試劑盒，北京博大科技公司生產的DNA片段玻璃奶回收試劑盒，上海博亞公司合成的Mcn5、β－actin引物。

1.4 檢測方法

1.4.1 MCM5的檢測 ①提取總RNA：將適量組織置于組織研磨器內，放入1ml Trizol試劑，研磨完全后將其轉至1.5ml EP管內；取所獲得的尿脫落細胞，放入1ml Trizol試劑，快速抽提并溶于由DEPC處理的雙蒸水內，置于－80℃冰箱內保存。②Nested RT－PCR：將1μg總RNA加入50μl反應體系中。過程如下：逆轉錄45℃，45min，90℃，5 min后，變性，94℃，30s后退火，56℃，50s后延伸，94℃，30s后結束（循環35次），作為第1次PCR。選擇首次PCR產物1μl，內引物5’－CAGGGATGAACTCAAGCGGC－3’和5’－CAGGCTACGAATGCTGGAAG－3’各1μl，按照上述過程進行第2次PCR。所生成產物按照20g／L瓊脂糖進行電泳，將β－action作為參照物，在同時有MCM5及β－actin目的片段時認為MCM5陽性，在只出現β－actin目的片段時認為陰性。采用英國Syngene公司生產的GENE GENUS凝膠圖像分析儀做凝膠圖像攝取及灰度值掃描。MCM5相對表達量采用MCM5／β－actin灰度值比表示。

1.4.2 尿細胞學檢查 利用HE染色，將脫落細胞懸液100μl置入涂片離心器內，500r／min離心1 min后涂片，略干燥后浸入高濃度酒精固定20min，行蘇木素染色后用流動水清洗，然后0.5%氨水藍化約30s，流動水清洗后置0.5%伊紅水30s，流動水清洗后浸入二甲苯，用中性樹脂封固讀片。將檢查結果中的中度核異質、重度核異質及腫瘤細胞認為陽性，通過分析靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值等評價檢測尿脫落細胞MCM5診斷膀胱癌的意義。

1.5 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，計量資料比較采用方差檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 膀胱癌組織標本中MCM5表達與臨床病理學特征間的關系

膀胱癌患者在不同病理分級、臨床分期的MCM5表達量差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 膀胱癌組織標本中MCM5表達與臨床病理學特征間的關系

2.2 尿脫落細胞MCM5表達與臨床病理學特征的關系

80例膀胱癌患者尿脫落細胞中有71例MCM5呈陽性表達，各組間比較差異有統計學意義（P＜0.05），膀胱癌患者尿脫落細胞MCM5陽性率在各病理分級與臨床分期上差異無統計學意義（P均＞0.05），但其表達量在各病理分級與臨床分期上差異有統計學意義（P均＜0.05），見表2。

表2 尿脫落細胞MCM5表達與臨床病理學特征的關系

2.3 尿脫落細胞MCM5檢測及尿細胞學診斷膀胱癌的效果

尿細胞學檢測膀胱癌患者中有36例陽性。與尿細胞學MCM5檢測比較，尿脫落細胞MCM5檢測診斷膀胱癌的靈敏度、陰性預測值較高，假陰性率較低，差異有統計學意義（P＜0.05），二者在特異度、假陽性率及陽性預測值方面比較則差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 尿脫落細胞MCM5檢測與尿細胞學診斷膀胱癌的效果比較 （%）

3 討論

MCM蛋白家族是由6個亞單位組成的親水的六聚體復合物，其mRNA水平隨著細胞周期而呈周期性變化，于G1后期表達最高，G0期表達最低，其中的MCM5是蛋白家族中具有代表性的亞單位之一。許多學者發現，MCM5不出現于終末分化細胞及靜止細胞，只表達于增殖細胞中，被認為是特異性增殖相關因子［2－4］。另有研究發現，MCM5在不典型增生及腫瘤組織中可擴展至上皮全層，而在正常組織中僅表達于上皮基底層的增殖區，基于此，通過檢測MCM5蛋白表達即可對是否有腫瘤細胞做出診斷［5－7］。

本研究中，80例膀胱癌患者尿脫落細胞中有71例MCM5呈陽性表達，且膀胱癌患者尿脫落細胞MCM5陽性率隨著病理分級及臨床分期的增加而升高，與既往研究結果一致。之所以能夠通過對尿脫落細胞MCM5檢測對膀胱腫瘤做出診斷，主要原因在于膀胱腫瘤細胞屬于典型的增殖細胞，不同于正常膀胱表層黏膜細胞所處的靜止期狀態，膀胱腫瘤細胞在增殖期可形成突入膀胱腔內的乳頭，而容易在尿液沖刷下脫落。正如前文所述，MCM5存在于不典型增生及腫瘤組織，故可通過對尿脫落細胞MCM5檢測做出膀胱腫瘤的診斷及預后評估［8－10］。在利用凝膠圖像半定量對結果分析后發現，MCM5表達量在各病理分級、臨床分期上有顯著差異，表明通過檢測尿脫落細胞中的MCM5有助于判斷膀胱癌腫瘤的惡性程度。

另外，本研究通過RT－PCR方法檢測尿脫落細胞MCM5診斷膀胱腫瘤的敏感度為88.75%，顯著高于尿細胞學檢查的45.00%，但特異度、假陽性率和陽性預測值比較差異無統計學意義，與既往研究結果類似。表明尿脫落細胞MCM5檢測在診斷膀胱癌方面靈敏度及特異度均較高，相比尿細胞學檢查具有較大的優勢［11］。

綜上所述，尿脫落細胞中MCM5檢測對膀胱癌診斷意義較大，是對膀胱腫瘤復發檢測、預后評價較好的指標，值得廣泛應用于臨床診斷。

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Detection of mini chromosome maintenance 5 protein in bladder carcinoma tissue and urine exfoliate cells

CAO Ran－hua，YUN Sheng，SU Wu－yun，et al.（The First Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University，Hohhot，Inner Mongolia 010050，China）

Objective To explore the expression and clinical significance of tiny chromosome maintenance protein（MCM）in bladder cancer tissue and urine exfoliated cells.Methods Urinary exfoliated cells or tissues of the bladder of hospitalized patients and healthy volunteers in our hospital from August 2012－August 2013were collected，and the urine exfoliated cells or tumor tissue MCM5was tested.Results ①The difference was statistically significant of clinical stagebladder cancer patients in different pathological grading MCM／β－actin（P＜0.05）.②There were 71cases with MCM5positive in 80bladder cancer patients with urinary exfoliated cells，differences between bladder cancer group and Normal control group or other urinary diseases group were statistically significant（P＜0.05）.③compared to urine cytology，sensitivity and negative predictive value of urine exfoliated cells MCM5detection and diagnosis of bladder cancer was significantly higher，false－negative rate was significantly lower，the difference was statistically significant（P＜0.05），There was no statistical significance difference in specific degree，false positive rate and positive predictive value（P＞0.05）.Conclusion Diagnosis of MCM5in urine exfoliated cells to detect bladder cancer have a greater sense，it is a recurrence of bladder cancer detection，prognosis better indicator，it is worth widely used in clinical diagnosis.

MCM5；Bladder tumor；Urine exfoliated cells；diagnosis

R737.14

A

曹冉華（1980－），女，碩士，主治醫師，從事實體瘤化療方面的研究。

2014－04－19）

1007－4287（2015）06－0927－03