腦白質疏松與空間學習及記憶功能障礙關系的研究

高強 馬春麗 張一娜 鄭秀海

腦白質疏松與空間學習及記憶功能障礙關系的研究

高強 馬春麗 張一娜 鄭秀海

目的 探討腦白質疏松與空間學習及記憶功能障礙的關系。 方法 將60只雄性SD大鼠隨機分為假手術組(n=30)和模型組(n=30),通過結扎雙側頸總動脈構建腦白質疏松模型,術前及術后3月分別進行Morris水迷宮實驗,同時觀察腦白質的組織學變化。 結果 定向航行階段,與假手術組相比,模型組尋找隱敝平臺能力下降(P<0.05),且于術后第2月開始出現(P<0.05),第3月改變明顯(P<0.01);空間探索階段,2組穿越次數差異無統計學意義(P>0.05);站臺周邊1路程顯示,模型組記憶能力較假手術組降低,此種改變于術后第3月出現(P<0.05)。模型組腦白質病理改變顯示質地疏松,出現大量空泡。 結論 腦白質疏松出現一定時間之后可導致空間學習及記憶障礙,并且空間學習能力受損早于記憶能力下降。

腦白質疏松; 學習及記憶; Morris水迷宮實驗

腦白質疏松(leukoaraiosis,LA)是一種年齡相關的神經退行性病變,影像學主要表現為腦室周圍、半卵圓中心斑點或斑片狀的改變,在核磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)T2加權像上表現為白質的高信號。目前,關于LA與認知障礙的關系尚缺乏明確結論。國外研究發現腦容積降低與認知功能障礙有關系[1];也有研究認為顳葉萎縮與認知功能障礙有關[2];Van等[3]認為認知功能下降與白質病變關系密切。本研究應用Morris水迷宮實驗結合腦室周圍白質的組織學改變來探討LA對大鼠空間學習及記憶能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用2～3月齡健康SD雄性大鼠60只,體質量200～250 g,由黑龍江省哈爾濱醫科大學附屬第二醫院實驗動物中心提供[許可證號:SCXK(黑)2013-001]。

1.2 方法

1.2.1 動物分組:采用隨機數字法將大鼠分為假手術組(n=30)和模型組(n=30)。組間鼠齡、體質量比較差異無統計學意義。2組觀察至術后3月。造模前及造模后每月均進行水迷宮實驗,共4次。每次實驗前均從各組隨機抽取5只大鼠斷頭取腦進行組織學觀察。將最終剩余10只大鼠的實驗數據進行統計學分析。

1.2.2 動物模型的制備:本研究采用永久性結扎雙側頸總動脈 (2-VO)法,制作LA動物模型。大鼠術前禁食12 h、禁水6 h。10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉,仰臥固定,頸前部去毛,碘酒消毒后,沿腹側頸正中切開,依次剪開筋膜,分離肌肉后從氣管旁游離出雙側頸總動脈,以0-4號線分別結扎頸總動脈近心端和遠心端后,將其剪斷以確保無血流通過。假手術組動物操作同前,分離但不結扎頸總動脈。

1.2.3 實驗裝置:水迷宮分析系統BW-MWM101由上海軟隆科技發展有限公司提供。水迷宮實驗按照Patil等[4]和Sase等[5]所述進行操作。實驗的設備包括圓形水池,登陸平臺,圖像采集系統(包括電腦、攝像機、廣角變焦透鏡、圖像采集芯片和顯示器)和數據收集、分析軟件。水池直徑180 cm,高60 cm,內壁為黑色,將水池分為4個象限,池壁上依次標上N、E、S、W字母,任選一象限放置平臺(平臺與圓心和池壁等距,本實驗為第4象限)。平臺呈圓柱形,高40 cm,直徑為10 cm。測試前用黑色食用色素將水染黑,水變得不透明,這樣一方面有利于捕捉信號,另一方面食用色素無毒,水不易變質,且不造成大鼠染色。將水放到高出平臺1 cm即可,使平臺位于水下,排除了大鼠看到平臺的可能。水溫保持在22 ℃～24 ℃之間,以免引起大鼠不適,干擾實驗結果。

1.3 觀察指標 學習記憶能力的測定:大鼠空間學習記憶能力測試Morris水迷宮實驗分為2部分:(1)定位航行實驗:用于測量大鼠對水迷宮學習的獲取能力。實驗歷時6 d。實驗前讓大鼠在水中自由游泳2 min,以適應水中的活動。從第2天起,每天上午固定時間進行訓練,保持周圍環境安靜,實驗人員不要隨意走動,盡可能將室內燈光關閉,利用自然光線。每天訓練4次,每次間隔15～20 min。訓練時隨機選擇一個入水點(避免大鼠同一入水點入水),將大鼠面向池壁放入水中,記錄大鼠尋找并爬上平臺所需的時間(即潛伏期)及游泳路線。每次訓練時間為60 s,如果大鼠在60 s內未找到平臺,須將其引至平臺,這時潛伏期記為60 s。(2)空間探索實驗:用于測量大鼠學會尋找平臺后,對平臺空間位置記憶的保持能力。在第6天撤除水下平臺,隨機選取入水點(平臺所在象限的對側)將大鼠面向池壁放入水中,測其在60 s內跨過原平臺相應位置的次數及站臺周邊1的路程。

1.4 灌注取腦 灌注方法如下:以胸骨最下端劍突處為出發點,向左右兩側剪開皮膚、肌肉等組織,進入腹腔。將腹部臟器撥向一邊,即可看見腹主動脈,止血鉗夾閉后,剪破膈肌進入胸腔。充分暴露心臟,在心尖偏左的位置進入穿刺針,固定后,剪開右心耳,生理鹽水灌注,約200 ml后改為4%多聚甲醛繼續灌注,待大鼠上肢及頸部變硬停止灌注。斷頭取腦,甲醛繼續固定24 h。以視交叉層面為起始,止于視神經發出層面,用于觀察腦室周圍白質。然后沖洗,梯度酒精脫水,二甲苯透明,再浸蠟包埋,片厚4 μm。用于常規蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色。

1.5 統計學分析 應用SAS 9.1.3版統計軟件,作圖用的軟件是Graphpad Prism 5.0,所有數值型連續變量的分析采用重復測量方差分析(ANOVA for repeated measurement),P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠造模后的改變 大鼠在動脈結扎后可見雙側眼裂明顯變小。與假手術組相比,行動遲緩,進食減少,但在1周內均恢復正常。

2.2 2組第4象限路程百分比比較 假手術組在第4象限的路程逐漸增加,模型組除最后1月略有減少外其余呈增加趨勢。同組內術后不同時間點與術前比較:假手術組術后各月均較術前顯著增加(P<0.01)。模型組術后第1月與術前比較無變化(P=0.275),術后第2月及第3月較術前均明顯增加(P<0.001)。同一時間點組間比較,術前及術后第1月2組間差異無統計學意義(P=0.192,P=0.097),術后第2月模型組較假手術組第4象限路程開始減少(P<0.05),術后第3月減少顯著(P<0.01)。見表1。

表1 2組第4象限路程百分比的比較

注:與同時間假手術組比較,*P<0.05;與同組術前比較,△P<0.05

2.3 2組潛伏期比較 除術后第3月外,2組潛伏期均隨時間延長而逐漸縮短。同組內術后各月與術前比較:2組潛伏期均較術前明顯縮短(P<0.01)。同一時間點組間比較:術前及術后第1月2組差異無統計學意義(P=0.146,P=0.062);模型組術后第2月及第3月較假手術組潛伏期延長(P<0.05)。見表2。

表2 2組潛伏期的比較

注:與同時間假手術組比較,*P<0.05;與同組術前比較,△P<0.05

2.4 2組穿越次數比較 撤去平臺后,模型組除術后第1月穿越次數較術前增加,其余月份與術前比較改變不明顯。假手術組術后均比術前穿越次數增加。但2組間無論是同組不同時間點還是同時間點不同組間的比較均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 2組穿越次數的比較次，n=10)

2.5 2組站臺周邊1路程(與站臺距離小于水池半徑1/4的區域)比較 模型組整體呈下降趨勢。假手術組除術后第3月外呈現逐漸增加的趨勢。同組不同時間點比較:與術前相比,假手術組術后站臺周邊1路程明顯增加(P<0.01);模型組則無變化(P>0.05)。同一時間2組間的比較顯示:術前及術后第1、2月均無統計學差異(P>0.05);術后第3月模型組站臺周邊1路程比假手術組減少(P<0.05)。見表4。

表4 2組站臺周邊1路程的比較

注:與同時間假手術組比較,*P<0.05;與同組術前比較,△P<0.05

2.6 LA的病理改變 大鼠腦組織HE染色可見，假手術組各時間點組織學改變無明顯差異,腦室周圍白質組織結構緊密,血管間隙正常,未見明顯疏松。模型組術前與假手術組差異不大,雙側頸總動脈結扎術后第1月:腦室周圍白質小范圍組織密度降低,出現少量空泡,同時可見增大的血管間隙;第2月:白質病變范圍增大密度降低較前明顯,空泡增多；第3月:白質出現大量的空泡,組織質地稀疏。見圖1。

注:A:假手術組；B：術后第1月；C：術后第2月；D：術后第3月圖1 腦室周圍白質

3 討論

認知是人腦接受外界信息,經過加工處理,轉換成內在的心理活動,從而獲取知識或應用知識的過程,包括記憶、語言、視空間、執行、計算和理解判斷等多方面內容。本研究主要檢測大鼠的學習及記憶功能,而水迷宮實驗定向航行和空間探索正是反映了大鼠的這2種功能,即逃逸潛伏期可以檢測獲取空間信息的能力,而探索過程主要反映記憶儲存及提取再現能力。

腦白質病變是中樞神經系統一種常見的影像學改變,尤其在老年人群中發生率約為60%～90%,盡管對于腦白質病變的研究越來越受到國內外學者的重視,但是其與學習、記憶的關系尚無明確結論[6-7]。本研究發現,LA確與空間學習及記憶障礙有關,但這種障礙并不是突然出現,而是一個逐漸加重的過程。在水迷宮實驗中,通過定位航行訓練,隨著時間推移大鼠尋找隱蔽平臺的能力逐漸增強,目標象限路程百分比逐漸增加,潛伏期逐漸縮短。這說明通過訓練,2組大鼠空間定位能力均得到提高。但術后相同時間點2組的比較顯示,模型組在術后第1月同假手術組相比結果無差異,且同術前相比也無明顯差異,但是在術后第2月假手術組結果開始優于模型組,術后第3月2組差異更顯著,這說明空間學習能力受損并不是術后馬上出現,而是一個隨時間積累逐漸加重的過程。空間探索實驗結果中2組穿越次數差異無統計學意義。但對站臺周邊1路程結果分析,2組有統計學差異,這說明假手術組在撤去平臺后記憶能力隨著實驗次數的增加顯著增強,而模型組記憶能力受損,于術后第3月開始出現。由此我們可以得出腦缺血可導致LA,在出現LA的初期,空間學習及記憶功能受損并不明顯,隨著LA時間的延長,有害因素的累積,認知障礙才逐漸出現,并且以空間學習能力受損較為顯著,記憶能力的損害相對較輕為其特點。同時,本實驗中同一批大鼠多次進行水迷宮實驗,從所得結果可以看出反復的記憶訓練可以減輕及減緩學習記憶功能的損害。國外研究也發現LA在認知功能下降之前就已經出現[8],同時導致認知功能損害的白質病變需要達到一定的閾值[9],才能出現臨床癥狀。這一結論也在本研究中得到證實。

腦室周圍白質與認知功能關系較為密切,而皮層下白質損害相對不重要,在前瞻性人群隊列研究中發現腦室旁白質損害越嚴重,癡呆發病風險越高,而皮層下白質損害與癡呆發病關系不明顯。白質病變導致學習及記憶障礙也是由其功能決定的。腦白質主要由神經纖維軸突與膠質細胞構成,是信息傳遞的重要通路,其中與記憶、情緒、行為等認知功能活動有關的纖維聯系分別通過腦室周圍形成多種邊緣環路與灰質相連,而白質較灰質更不耐受缺血。因此當缺血發生時,由于腦室旁白質病變范圍是責任血管的“遠端供血區”,即動脈供血的分水嶺區;同時供血動脈缺少側支循環或缺如,因此引起神經纖維脫髓鞘，使白質與皮質之間的聯系纖維中斷,進而導致學習、記憶功能障礙。本研究證明當缺血發生1月時白質就已經有了脫髓鞘的改變。而相關研究通過電鏡觀察同樣證實在缺血20 d胼胝體和內囊有髓纖維髓鞘變形、板層結構疏松、崩潰,血管旁水腫[10]。但是缺血初期受損的神經纖維數量相對較少,信息傳遞受到的影響不明顯。隨著缺血時間延長,腦室周圍白質受累面積增大,脫髓鞘明顯,空泡增多,導致大量組織疏松。同時皮層神經元出現大量凋亡，于是學習及記憶功能受累,出現臨床癥狀。

綜上所述,LA與空間學習及記憶障礙有關。早期對其進行干預可以減慢病情的發展,減輕患者認知功能的損害。

[1] Shenkin SD, Bastin ME, Macgillivray TJ, et al. Cognitive correlates of cerebral white matter lesions and water diffusion tensor parameters in community-dwelling older people[J]. Cerebrovasc Dis, 2005,20(5):310-318.

[2] Firbank MJ, Burton EJ, Barber R, et al. Medial temporal atrophy rather than white matter hyperintensities predict cognitive decline in stroke survivors[J]. Neurobiol Aging, 2007, 28(11):1664-1669.

[3] Van Dijk EJ, Prins ND, Vrooman HA, et al. Progression of cerebral small vessel disease in relation to risk factors and cognitive consequences: Rotterdam Scan Study[J]. Stroke, 2008,39(10):2712-2719.

[4] Patil SS, Sunyer B, H?ger H, et al. Evaluation of spatial memory of C57BL/6J and CD1 mice in the Barnes maze, the Multiple T-maze and in the Morris water maze[J]. Behav Brain Res, 2009,198(1):58-68.

[5] Sase A, Khan D, H?ger H, et al. Intraperitoneal injection of saline modulates hippocampal brain receptor complex levels but does not impair performance in the Morris Water Maze[J]. Amino Acids, 2012,43(2):783-792.

[6] Schenk C, Wuerz T, Lerner AJ. Small vessel disease and memory loss: what the clinician needs to know to preserve patients’ brain health[J]. Curr Cardiol Rep, 2013,15(12):427.

[7] Grueter BE, Schulz UG. Age-related cerebral white matter disease (leukoaraiosis): a review[J]. Postgrad Med J, 2012,88(1036):79-87.

[8] Schmidt R, Petrovic K, Ropele S, et al. Progression of leukoaraiosis and Cognition[J]. Stroke, 2007,38(9):2619-2625.

[9] Pantoni L, Poqqesi A, Basile AM, et al. Leukoaraiosis predicts hidden global functioning impairment in nondisabled older people: the LADIS (Leukoaraiosis and Disability in the Elderly) Study[J]. J AM Geriatr Soc, 2006,54(7):1095-1101.

[10]葉欽勇,詹增土,鄭安,等. 慢性全腦低灌注大鼠側腦室旁白質改變及其與基質金屬蛋白酶表達的關系[J].中華老年醫學雜志, 2013,32(2):215-218.

Association of leukoaraiosis with spatial learning and memory dysfunction

GAOQiang,MAChun-li,ZHANGYi-na,ZHENGXiu-hai.DepartmentofGeriatics,theSecondAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150086,China

Objective To investigate the association of leukoaraiosis with spatial learning and memory dysfunction. Methods Sixty male SD rats were randomly divided into sham group and model group with 30 rats in each group. Leukoaraiosis model was constructed by bilateral carotid artery ligation. The rats should undergo Morris water maze test for 4 times. Histological changes of the white matter were observed. Results In directional navigation phase,compared with the sham group, learning ability of model group decreased (P<0.05)which began from the second month (P<0.05), and decreased significantly in the third month (P<0.01). In space exploration phase,crossing times of the two groups were of no difference (P>0.05).The data of platform peripheral 1 indicated that memory platform was significantly enhanced in sham group (P<0.01),but weakened in model group. Memory impairment of model group appeared in the third month. Pathology in the model group showed that white matter density decreased and vacuoles appeared. Conclusions Leukoaraiosis could lead to spatial learning and memory disorders. The impairment of spatial learning appeared earlier than memory decline.

leukoaraiosis; learning and memory; morris water maze test

黑龍江省衛生廳基金資助項目(2014-313)

150086黑龍江省哈爾濱市，哈爾濱醫科大學附屬第二醫院老年病科

R 749.1

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2015.11.008

2014-12-30)