酶聯免疫分析檢測乙型肝炎e抗原的空白限、檢出限及定量限的建立與評價*

胡 敏，楊澤華，趙克斌(山西醫科大學第一醫院醫學檢驗科，太原 030001)

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·論 著·

酶聯免疫分析檢測乙型肝炎e抗原的空白限、檢出限及定量限的建立與評價*

胡 敏，楊澤華，趙克斌△(山西醫科大學第一醫院醫學檢驗科，太原 030001)

目的 建立并評價酶聯免疫分析手工操作檢測HBeAg的空白限(LoB)、檢出限(LoD)及定量限(LoQ)。方法 參照美國臨床實驗室標準化協會EP-17A文件和有關文獻，結合工作實際，將HBeAg的空白樣品及系列低濃度樣品進行酶聯免疫分析手工操作的檢測，根據數據的分布規律，采用相應的統計學方法，建立酶聯免疫分析手工操作檢測HBeAg的LoB、LoD及LoQ并進行評價。結果 HBeAg的LoB為0.131 PEI U/mL，LoD為0.350 PEI U/mL，LoQ為0.450 PEI U/mL。結論 廠商聲明的LoB得到驗證，同時建立了實驗室檢測HBeAg的LoB、LoD和LoQ，為臨床診斷和治療提供更有價值的信息。

乙型肝炎e抗原； 酶聯免疫吸附試驗； 空白限； 檢出限； 定量限

乙型肝炎e抗原(HBeAg)是乙型肝炎病毒(HBV)C基因轉錄生成的循環蛋白，與乙型肝炎表面抗原一樣，是乙型肝炎(簡稱乙肝)的直接指征，它的持續陽性提示疾病慢性化，可能會進展為慢性活動性肝炎、肝硬化[1]。慢性乙肝患者接受干擾素或核苷酸類藥物治療時，血清HBeAg水平的高低直接反映患者的預后情況，因此HBeAg常用于評估乙肝抗病毒療效及傳染性強弱[2-3]。當今國內HBeAg檢測方法和儀器種類繁多，如何確保檢測系統間結果的可靠性成為當務之急[4]。本研究主要參照美國臨床實驗室標準化協會發布的《確定檢出限值和定量限值方案》，對酶聯免疫分析檢測HBeAg的空白限(LoB)、檢出限(LoD)和定量限(LoQ)進行建立和評價，旨在為臨床提供更可靠的診斷信息[5]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 酶聯免疫分析手工操作，試劑(批號201406101)由上海科華生物工程股份有限公司提供；美國PerkinElmer Wallac 1235全自動時間分辨熒光免疫分析儀，試劑(批號8600021769)由蘇州新波生物技術有限公司提供；美國雷勃Wellscan MK3酶標儀。

1.2 樣品制備 收集PE公司1235全自動時間分辨熒光免疫分析儀檢測HBeAg水平為0 PEI U/mL的健康人新鮮血清50例混勻作為空白樣品，并檢測證實此混合血清HBeAg水平為0 PEI U/mL；用空白樣品對原始HBeAg樣品作系列稀釋，配置成系列低濃度HBeAg樣品，其理論水平分別為0.15、0.25、0.35、0.45、0.55 PEI U/mL，介于LoB水平的1～4倍。所有樣品均無溶血、無黃疸、無脂濁，分裝于EP管中置-20 ℃冰箱保存。

1.3 方法

1.3.1 試驗基本要求 試驗前嚴格按照廠商操作規程對儀器進行維護、校準和質量控制，確認質量控制結果在控的前提下方可檢測樣品。

1.3.2 LoB的確定[6]對空白樣品進行60次測定，每日1批，每批重復檢測12次，共5 d，記錄吸光度值A。按國際標準化組織，設定Ⅰ類錯誤與Ⅱ類錯誤水平均為5%，即α=β=5%，5%的α值相當于使用空白值分布的95%百分位數，作為顯著高于空白的檢測值的限值。若空白值呈正態分布，按以下公式計算LoB：LoB=μB+1.645σB，其中μB和σB分別是空白檢測的均值和標準差。若空白值呈非正態分布，則用非參數方法估計第95%百分位數。將檢測值依據大小排列，求相應的百分位數ρ=(100-α)=95，LoB=[nB(95/100)+0.5]位置的結果，式中nB為空白樣品的重復檢測次數，即nB=60。

1.3.4 LoQ的確定[6]依據臨床要求和室間質量評價的允許誤差，設定本實驗室HBeAg的總誤差目標為20%，在不考慮分析偏差的條件下，總誤差=2CV，若低濃度樣本的CV≤1/2TEa，則LoQ=LoD；若TEa大于實驗室制訂的質量目標20%，則需要選擇更高濃度的定值樣品重復檢測。

2 結 果

2.1 標準曲線的建立 濃度為0、0.970、2.260、6.590、7.490、14.980 PEI U/mL的各樣品其吸光度值分別為：0.005、0.169、0.643、1.512、1.899、2.552。將以上數據通過CurveExpert1.4進行曲線擬合，結果顯示二次多項式擬合法的擬合程度最高，標準曲線見圖1。

2.2 LoB的建立 空白樣品的檢測結果經正態性檢驗，呈非正態分布，因此用非參數方法估計LoB，即估計第95%百分位數，將60個空白值由小到大排序后第51～60位數值見表1，LoB在[60×(95/100)+0.5]=57.5位置的值，即LoB=(57號結果+58號結果)/2，第57.5位結果為(0.131+0.131)/2=0.131 PEI U/mL，即LoB為0.131 PEI U/mL。

圖1 HBeAg濃度-吸光度曲線

秩號空白值秩號空白值510．128560．128520．128570．131530．128580．131540．128590．131550．128600．138

2.3 LoD的建立 系列低濃度樣品測定結果見表2。60個低濃度樣品檢測結果呈非正態分布，使用非參數程序估計LoD，即LoD = LoB+Ds、β，其中Ds、β是低濃度樣品測定值中位數的值和第5個百分位數值的間距。運用SPSS19.0計算，中位數為0.392 PEI U/mL，第5百分位數的值為0.173 PEI U/mL，Ds、β=0.392-0.173=0.219 PEI U/mL。LoD=LoB+Ds、β=0.131+0.219=0.350 PEI U/mL。

表2 系列低濃度樣品測定結果

注：xi1和xi2為同一天內的2批測定結果。

表3 酶聯免疫分析手工操作檢測HBeAg低濃度樣品的日間CV

2.4 LoQ的建立 本實驗室依據臨床需求及權威機構規定的分析質量要求設定酶聯免疫分析手工操作檢測HBeAg的總誤差目標為20%，在不考慮分析偏差的情況下，TEa=2CV，即CV=1/2TEa。HBeAg濃度在0.450 PEI U/mL時檢測的日間變異為8.95%，接近10.00%，符合質量目標要求，因此LoQ=0.450 PEI U/mL。見表3。

3 討 論

HBeAg/HBeAb血清學轉換是HBV復制下降的可靠標志，HBeAg陽性與否使慢性乙肝患者的臨床經過和治療應答效果有很大差別。但是任何定量試驗均存在可接受的偏差，定性試驗也必然存在一定的漏檢率[7]。為了防止弱陽性標本的漏檢，有效地提高檢出率，各臨床實驗室可以科學地建立滿足各實驗室自己質量要求的檢測限，將更準確的檢測結果反饋給臨床[8]。

LoB、LoD和LoQ是評價檢測方法或檢測系統靈敏性的重要參數，因此LoD與LoQ的設定是至關重要的，因為確定極微量的待測物質對于疾病的確定，尤其是傳染性疾病的確診具有很大意義[9]。EP17-A文件就如何確定臨床檢驗方法的檢測低限，如何基于實驗室在低水平濃度處的性能目標確定定量檢測限提出了建議。本研究嚴格按照EP17-A方案，建立了酶聯免疫分析手工操作檢測HBeAg的LoB為0.131 PEI U/mL，低于廠商說明書聲明的靈敏度0.154 PEI U/mL，LoD為0.350 PEI U/mL，LoQ為0.450 PEI U/mL。使用酶聯免疫分析手工操作檢測HBeAg結果報告時，若HBeAg結果低于0.131 PEI U/mL，則報告“分析物未檢出，濃度低于0.131 PEI U/mL”；若HBeAg結果高于0.131 PEI U/mL，低于0.350 PEI U/mL，則報告“有分析物檢出，但不能準確定量，濃度小于0.350 PEI U/mL”；若HBeAg結果高于0.450 PEI U/mL，則直接報告檢測結果。

已有研究證實，全自動酶免檢測設備在過程處理的速度、靈敏度和精密度方面均優于手工操作，因其試驗的全過程加樣、加試劑、孵育、洗板、結果判讀等均由電腦控制，消除了手工操作的人為誤差，使得加樣、加試劑準確，孵育時間嚴格控制，檢測的靈敏度相應提高[10]。本科室已引入Addcare ELISA 1100全自動酶免疫分析系統及Beckman Coulter公司Power Express自動化流水線，全自動酶聯免疫分析儀將成為酶聯免疫實驗室的主導設備，酶聯免疫實驗室的自動化與標準化是實現全實驗室自動化的一部分。根據CNAS-CL02：2012《醫學實驗室質量與能力認可準則》的要求，設備在安裝時及常規使用中應顯示出能夠達到規定的性能標準。以后作者將對Addcare ELISA 1100全自動酶免儀的分析性能進行系統、全面的評價[11]。

[1]Lang T,Lo C,Skinner N,et al.The hepatitis Be antigen(HBeAg)targets and suppresses activation of the toll-like receptor signaling pathway[J].Hepatol,2011,55(4):762-769.

[2]郝迎迎,夏娟,劉勇，等.血清HBeAg定量檢測對慢性乙型肝炎患者核苷(酸)類似物治療后e抗原血清轉化的預測作用[J/CD].中華臨床醫師雜志：電子版,2012,6(11):2915-2920.

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[4]蘇榮，葉桂樣，羅娜，等.乙型肝炎病毒E抗原檢測方法性能的初步評價[J].實驗與檢驗醫學,2013,2(31):21-23.

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Establishment and evaluation of limit of blank,limit of detection and limit of quantitation for detection of HBeAg by enzyme-linked immunosorbent assay*

HUMin,YANGZe-hua,ZHAOKe-bin△

(DepartmentofClinicalLaboratory,FirstHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan,Shanxi030001,China)

Objective To establish the limit of blank(LoB),limit of detection(LoD) and limit of quantitation(LoQ) for the detection of HBeAg by the enzyme-linked immunosorbent assay.Methods Referring to CLSI EP-17A protocol and related literature,and by combining with our actual works,the blank sample and a series of low concentration samples were performed the ELISA detection by the manual operation.According to the distribution law of the data,the corresponding statistical method was adopted to establish the ELISA detection of LoB,LoD and LoQ of HBeAg by the manual operation.Results LoB of HBeAg measured by the manual operation was 0.131 PEI U/mL,LoD was 0.350 PEI U/mL and LoQ was 0.450 PEI U/mL.Conclusion The LoB of HBeAg stated by the manufacturer is verified.At the same time,LoB,LoD and LoQ of HBeAg detected by our laboratory are established,which provide more valuable information for the clinical diagnosis and therapy.

HBeAg; enzyme-linked immunosorbent assay; limit of blank; limit of detection; limit of quantitation

衛生部醫藥衛生科技發展研究中心資助項目(28-1-45)。

胡敏，女，碩士，初級檢驗師，主要從事檢驗方法學方面的研究。△

，E-mail：syyyjykzkb@sina.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.18.004

A

1672-9455(2015)18-2656-03

2015-04-10

2015-05-10)