外周血T細胞亞群及IL-17、IL-10在原發性干燥綜合征的表達*

牛廣華,張藝凡,高玉潔,嚴 峰(遼寧中醫藥大學附屬醫院臨床檢驗中心，沈陽 110032)

?

·論 著·

外周血T細胞亞群及IL-17、IL-10在原發性干燥綜合征的表達*

牛廣華,張藝凡,高玉潔△,嚴 峰(遼寧中醫藥大學附屬醫院臨床檢驗中心，沈陽 110032)

目的 研究外周血T細胞亞群及IL-17、IL-10在原發性干燥綜合征(pSS)患者中的表達。方法 選取該院風濕科門診或住院診斷的pSS患者89例，健康對照組選自該院健康體檢者38例，用流式細胞儀檢測外周血T細胞亞群及ELISA檢驗血清中的IL-17、IL-10表達水平。結果 外周血T細胞亞群檢測結果顯示，pSS患者CD3+與健康人比較差異無統計學意義(P>0.05)；CD4+較健康人明顯下降(P<0.05)；CD8+較健康人極明顯升高(P<0.05)；CD4+/CD8+較健康人極明顯下降(P<0.05)；細胞因子檢測結果顯示，IL-17水平較健康人明顯升高(P<0.05)；IL-10水平較健康人極明顯降低(P<0.05)。結論 pSS患者較健康人存在明顯的T細胞免疫異常，患者自身存在炎性反應及缺乏對炎性反應的抑制功能。

原發性干燥綜合征； T細胞亞群； 白細胞介素-17； 白細胞介素-10

干燥綜合征又名舍格倫綜合征(SS)，是一個主要侵犯外分泌腺體，表現以口干、咽干等癥狀為特征的自身免疫性疾病。本病可分為原發性干燥綜合征(pSS)和繼發性干燥綜合征(sSS)兩種。pSS在我國人群患病率為0.3%～0.7%，目前其確切的發病機制尚不清楚，其中細胞免疫學機制是研究的熱點[1]。白細胞介素(IL)-17主要由近期新發現的CD4+T細胞亞群Th17細胞分泌，已知Th17細胞主要分泌IL-17A、IL-17F和IL-6、IL-21、IL-22、TNF-α等多種細胞因子。IL-17作為目前新發現的細胞因子，可以促進白細胞的遷移和活化，從而加重炎性反應。一些研究顯示，Th17細胞與干燥綜合征、類風濕關節炎、銀屑病、炎性腸病等疾病的發病有關[2-4]。IL-10是一種抑制性細胞因子，由Treg細胞——目前已知的具有抗炎作用的CD4+T細胞亞群產生，IL-10在移植免疫及微生物感染中起著重要的抑制作用。本文旨在研究IL-17、IL-10、T淋巴細胞亞群在pSS中的表達情況，以進一步探討pSS的發病機制，為其提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 按照2002年修訂的干燥綜合征國際診斷(分類)標準[5]，選擇2013年8月至2014年8月于遼寧中醫附屬醫院風濕科門診或住院診斷的pSS患者89例，其中女80例，男9例；年齡22～68歲，平均(51.05±12.23)歲；病程最短3個月，最長11年，平均(5.3±2.16)年。健康對照組選自本院女性健康體檢者38例，年齡30～72歲，平均為(55.30±13.33)歲。除去試驗前接受有關藥物治療(如激素或免疫抑制劑)的患者。

1.2 儀器與試劑 儀器采用美國BD公司BD FACSCalibur全自動流式細胞儀;美國BIORAD680酶標儀。外周血T細胞亞群分析試劑盒，美國BD Bioscience 生產，批號90885；IL-17酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒，武漢優爾生科技股份有限公司，批號L140218305；IL-10 ELISA檢測試劑盒，武漢優爾生科技股份有限公司，批號L140218300。

1.3 方法

1.3.1 外周血標本采集 晨空腹取靜脈血3 mL于EDTA-K2真空抗凝采血管中，用于檢測外周血T細胞亞群；同時晨空腹取靜脈血4 mL于真空促凝采血管，3 000 r/min離心10 min后分離血清,-80 ℃冰箱保存進行IL-17、IL-10批量檢測。

1.3.2 外周血T細胞亞群檢測 分別加入試劑A(含鼠抗人CD3-FITC/CD8-PE/CD4-APC/CD45-PerCP)5 μL于試管內，再加入25 μL全血，震蕩混勻，避光溫育10 min；再加入預先10倍稀釋的溶血素300 μL，室溫避光放置5 min,待全血溶為紅色透明即可上機；上機測試，存盤后用CELLQuest軟件進行數據分析。

1.3.3 ELISA檢測血清中IL-17、IL-10水平 取上述凍存的血清，采用ELISA雙抗體夾心法檢測IL-17、IL-10,具體操作按照試劑盒說明書進行。用美國BIORAD680酶標儀在450 nm波長測量每孔的吸光度,所測OD值減除空白值，以標準品OD值用curveExpert 1.3軟件繪制出標準曲線，根據待測樣品OD值分別計算出該患者的IL-17、IL-10水平。

2 結 果

2.1 pSS患者和健康對照組外周血中T淋巴細胞亞群表達水平 經統計學處理，與健康對照組比較，pSS外周血CD4+明顯下降(P<0.05)；CD8+極明顯升高(P<0.05)；CD4+/CD8+極明顯下降(P<0.05)；CD3+差異無統計學意義(P>0.05)；見表1及見圖1、2。

2.2 pSS患者及健康對照組血清IL-17、IL-10的表達 經統計學處理，與健康對照組比較，pSS血清中IL-17水平明顯升高(P<0.05)；而IL-10水平極明顯降低(P<0.05)，見表2。

表1 pSS患者和健康對照組外周血T淋巴細胞 亞群表達水平

圖1 pSS外周血T淋巴細胞表達分析

圖2 健康人外周血T淋巴細胞表達分析

組別nIL?17IL?10pSS組8937．61±14．4722．24±6．89對照組3810．04±2．7139．86±10．13P0．0570．000

3 討 論

pSS是一種慢性炎性反應疾病。對本病的治療因暫無有效方法，大多是采用替代治療及對癥治療，針對因免疫反應導致的組織器官損害，起到控制或延緩的作用。而對pSS發病機制的進一步研究將有利于探索本病新的治療靶點[4]。

目前對pSS的研究中，以免疫學和分子生物學角度研究較多。多數學者認為，T細胞參與了pSS的組織損傷過程。T細胞作為人體重要的免疫細胞之一，介導細胞免疫，輔助體液免疫。根據細胞表型的不同分為 CD3+CD4+CD8-T細胞(即CD4+T細胞)，CD3+CD4-CD8+細胞毒性T細胞(即CD8+T細胞)，CD4+T細胞又可分為炎性細胞(Th1、Th17)、輔助性細胞(Th2)和抑制性細胞(Treg)。而細胞免疫有兩種形式：一種是CD8+CTL介導的特異性殺傷靶細胞的效應；另一種是CD4+Th1細胞介導的以單個核細胞浸潤為主的炎性反應。本試驗的pSS患者外周血CD3+T細胞總數與健康對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)；但T細胞亞群中CD4+T細胞明顯下降，CD8+T細胞數目明顯升高(P<0.05)，CD4+/CD8+也明顯較健康對照組低(P<0.05)，表明pSS患者存在T細胞免疫功能異常。這與李昕等[6]、武加標等[7]的研究結果相一致。

IL-17是一種主要由Th17產生的細胞因子，其促炎作用毋庸置疑，而沒有其他冗余功能。它可以清除體內病原體而引發炎性反應，其數量的多少一定程度上可以反映Th17細胞的數量或功能。Wong等[8]研究顯示，與對照組比較，SLE患者分泌IL-17A的Th17細胞數量明顯增高，患者血漿中IL-17、IL-23、Th17水平也明顯增高，并且IL-17水平與系統性紅斑狼瘡疾病活動性指數呈正相關。有研究發現，SS患者唇腺組織中有IL-17表達，且在少量淋巴細胞浸潤組中表達的比例顯著高于多量淋巴細胞浸潤組，認為IL-17可能在pSS疾病發生淋巴細胞浸潤的早期起著重要的作用[9]。孟潔等[10]研究發現IL-17對B細胞功能異常可能有協同作用，而導致pSS局部炎性反應的損傷過程。作者的研究結果顯示，pSS患者血清IL-17較健康對照組顯著升高,進一步提示IL-17可能參與了pSS的發病過程。

IL-10作為具有抑制炎性反應作用的細胞因子，其抑制作用可解釋為它抑制促炎細胞因子的產生，如樹突細胞產生的IL-12、巨噬細胞產生的TNF,并且下調抗原呈遞細胞表面表達主要組織相容性復合體和共刺激分子CD80與CD86，這樣抑制了APC對T細胞的抗原提成作用，從而導致后續的抑制T細胞的活化，進一步影響效應T細胞引發炎性反應的能力[11]。IL-10不僅被許多適應性免疫系統的細胞表達,包括T細胞和B細胞，還可由先天免疫細胞,包括樹突細胞、巨噬細胞、肥大細胞和自然殺傷細胞分泌。但主要分泌IL-10的是一類CD4+T細胞亞群——Treg細胞。研究IL-10的數量也可間接反映Treg細胞的情況。本試驗結果pSS患者血清IL-10較健康對照組顯著下降，顯示其對IL-17促炎因子不能有效地抑制，從而無法對本病的慢性炎性反應起到抑制作用，最終使病情加重。

pSS是一種復雜的風濕免疫疾病，針對T細胞亞群及其細胞因子的研究，有望為患者帶來新的治療方向。

[1]Ruddy S,Harris ED Jr,Sledye CB．Kelley′s textbook of rheumatology[M]．6th ed．Philadelphia：W．B．Saunders Company,2001：1028-1035.

[2]Veldhoen M，Hocking RJ，Atkins CJ，et al．TGF beta in the context of aninflammatory cytokinemilieu supports de novo differentiation of IL-17 producing T cells[J]．Immunity,2006，24(9)：17-18.

[3]李偉毅，鮑春德.免疫系統[M].上海：上海交通大學出版社，2010:1.

[4]王琳.干燥綜合征患者外周血Th17、Treg及B細胞研究[D].北京：協和醫學院，2009:39.

[5]中華醫學會.干燥綜合征.臨床診療指南風濕病分[M].2011:40.

[6]李昕,邱宇杰,韓建平.原發干燥綜合征患者外周血T細胞亞群變化的相關研究[J].天津醫科大學學報，2008，14(1):51-54.

[7]武加標,任敏,肖菁.原發性干燥綜合征62例血清學特點分析[J].蚌埠醫學院學報，2010，35(11):1093-1095.

[8]Wong CK，Ho CY,Li EK，et al．Elevmion of proinflammatorycytokine(IL-18，IL-17，IL-2)and the cytokine(IL-4)concentrations inpatients with systemic lupus erythematosus[J]．Lupus，2000，9(8)：589-593.

[9]王喜梅，歷小梅，李向培，等．白細胞介素17在原發性干燥綜合征患者唇腺組織和外周血的表達[J]．中華風濕病學雜志，2009，13(5)：292-295.

[10]孟潔,俞大亮,厲小梅,等.干燥綜合征中白細胞介素-17與B細胞活化因子對B細胞功能異常的協同作用[J].中華風濕病學雜志，2013，17(6):369-372.

[11]Fiorentino DF,Zlotnik A,Vieira P,et al.IL-10 acts on the antigen-presenting cell to inhibit cytokine production by Th1 cells[J].J Immunol,1991,146(10):3444-3451.

Expression of peripheral blood T-lymphocyte subsets,IL-17 and IL-10 in primary Sjogren′s syndrome*

NIUGuang-hua,ZHANGYi-fan,GAOYu-jie△,YANFeng

(ClinicalLaboratoryCenter,AffiliatedHospitalofLiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang,Liaoning110032,China)

Objective The research the expression of peripheral blood T-lymphocyte subsets，IL-17 and IL-10 in primary Sjogren′s Syndrome(pSS).Methods 89 patients with pSS diagnosed in the outpatient department of rheumatic disease or the inpatient department of our hospital were selected.And 38 healthy persons undergoing the physical examination were selected as the control group.T-lymphocyte subsets were identified and classified by the flow cytometer.The expression levels of IL-17 and IL-10 in serum were detected by ELISA.Results The results of peripheral blood T-lymphocyte subsets showed that CD3+had no statistical differences between healthy people and pSS patients(P>0.05),the CD4+level in the pSS patients was obviously lower than that in the normal persons(P<0.05),while CD8+was extremely increased compared with the normal healthy persons(P<0.05) and CD4+/CD8+was extremely decreased compared with the normal healthy persons (P<0.05).The results of cytokines showed that the level of IL-17 was significantly increased compared with the healthy persons (P<0.05) and the IL-10 level extremely decreased compared with the normal healthy persons (P<0.05).Conclusion Compared with the healthy persons,the obvious immune abnormality of T-lymphocyte exists in the pSS patients,the patients themselves exist the inflammatory reaction and lack the inhibitory ability to inflammatory reaction.

primary Sjogren′s syndrome； T-lymphocyte subsets； interleukin-17； interleukin-10

遼寧省自然科學基金資助項目(2014020049)。

牛廣華，男，博士，主任技師，從事臨床免疫學、自身免疫疾病的研究。△

E-mail:jie_54@sohu.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.18.007

A

1672-9455(2015)18-2664-02

2015-04-20

2015-05-15)