結核分枝桿菌去乙酰化酶2的克隆及酶學研究

林雅寧,董 劍，徐忠玉(中國人民解放軍第一七五醫院/廈門大學附屬東南醫院檢驗科，福建漳州 363000)

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·論 著·

結核分枝桿菌去乙酰化酶2的克隆及酶學研究

林雅寧,董 劍，徐忠玉(中國人民解放軍第一七五醫院/廈門大學附屬東南醫院檢驗科，福建漳州 363000)

目的 構建結核分枝桿菌去乙酰化酶2(Sir2)原核表達載體，并進行表達純化及酶學研究。方法 以結核分枝桿菌H37Rv基因組DNA為模板，聚合酶鏈反應擴增Sir2基因，構建pET-28a-Sir2重組質粒，在E.coli BL2(DE3)中誘導表達蛋白，經Ni2+-NTA柱純化，最后通過去乙酰化酶試驗測定Sir2酶活的最適反應溫度和pH值，以及吡嗪酰胺對其酶活的影響。結果 成功構建了Sirt2原核表達載體，并能在E.coli BL21(DE3)中高效表達。隨后對純化的Sir2蛋白進行依賴于NAD+的去乙酰化活性研究，得到該酶的最適反應溫度是25 ℃，最適反應pH值是9.0。在偏酸性環境中，吡嗪酰胺對酶活有抑制，而在偏堿性環境中，沒有抑制作用。結論 利用分子克隆技術，獲得了高純度的Sir2蛋白并獲得其酶活最適反應溫度和最適pH值，及吡嗪酰胺對其有抑制效果，為研究抗結核藥物吡嗪酰胺的抑菌機制提供一定基礎。

結核分枝桿菌； 去乙酰化酶； 基因克隆； 蛋白純化； 吡嗪酰胺

結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis H37Rv)是目前全球最可怕的流行性致病菌之一，結核病在我國的發病率呈回升趨勢[1-3]。隨著化療藥物的廣泛應用，結核桿菌的耐藥率日趨上升，特別是耐多藥結核病(MDR-TB)，給結核病的控制工作帶來巨大困難[4-5]。因此，尋找一種有效的藥物靶標分子的任務迫在眉睫。……