結核分枝桿菌去乙酰化酶2的克隆及酶學研究

林雅寧,董 劍，徐忠玉(中國人民解放軍第一七五醫院/廈門大學附屬東南醫院檢驗科，福建漳州 363000)

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·論 著·

結核分枝桿菌去乙酰化酶2的克隆及酶學研究

林雅寧,董 劍，徐忠玉(中國人民解放軍第一七五醫院/廈門大學附屬東南醫院檢驗科，福建漳州 363000)

目的 構建結核分枝桿菌去乙酰化酶2(Sir2)原核表達載體，并進行表達純化及酶學研究。方法 以結核分枝桿菌H37Rv基因組DNA為模板，聚合酶鏈反應擴增Sir2基因，構建pET-28a-Sir2重組質粒，在E.coli BL2(DE3)中誘導表達蛋白，經Ni2+-NTA柱純化，最后通過去乙酰化酶試驗測定Sir2酶活的最適反應溫度和pH值，以及吡嗪酰胺對其酶活的影響。結果 成功構建了Sirt2原核表達載體，并能在E.coli BL21(DE3)中高效表達。隨后對純化的Sir2蛋白進行依賴于NAD+的去乙酰化活性研究，得到該酶的最適反應溫度是25 ℃，最適反應pH值是9.0。在偏酸性環境中，吡嗪酰胺對酶活有抑制，而在偏堿性環境中，沒有抑制作用。結論 利用分子克隆技術，獲得了高純度的Sir2蛋白并獲得其酶活最適反應溫度和最適pH值，及吡嗪酰胺對其有抑制效果，為研究抗結核藥物吡嗪酰胺的抑菌機制提供一定基礎。

結核分枝桿菌； 去乙酰化酶； 基因克隆； 蛋白純化； 吡嗪酰胺

結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis H37Rv)是目前全球最可怕的流行性致病菌之一，結核病在我國的發病率呈回升趨勢[1-3]。隨著化療藥物的廣泛應用，結核桿菌的耐藥率日趨上升，特別是耐多藥結核病(MDR-TB)，給結核病的控制工作帶來巨大困難[4-5]。因此，尋找一種有效的藥物靶標分子的任務迫在眉睫。去乙酰化酶(Sir2)蛋白是一類依賴于NAD+的去乙酰化酶，它在細胞的長壽與衰老、基因沉默、凋亡等生理活動中具有十分重要的調節作用[6]。近年來Li發現了Sir2參與了分枝桿菌的非同源末端連接修復[7]。Sir2抑制p53蛋白的乙酰化，從而抑制依賴于p53蛋白的細胞凋亡，使DNA損傷修復有更充裕的時間[8]。Sir2蛋白具有ADP-核糖基轉移酶活性和依賴于NAD的去乙酰化酶。煙酰胺是Sir2家族蛋白的天然抑制物，早期研究發現煙酰胺對結核菌有良好的抑制效果，因此，作者猜測PZA的作用機制可能與Sir2有關[9-10]。本文克隆表達結核分枝桿菌的Sir2蛋白，對它的去乙酰酶活進行鑒定，并檢測PZA對其抑制效果，期望通過對結核分枝桿菌Sir2蛋白的研究，能為抗結核病藥物PZA的作用機制和耐藥機制提供新線索，為結核新藥的設計和篩選提供靶標和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 結核分枝桿菌H37Rv由漳州疾控中心贈送，用于克隆、表達的質粒pET28a，大腸桿菌菌株E.coli BL21(DE3)均由本實驗室保存。

1.2 儀器與試劑 聚合酶鏈反應(PCR)儀購自美國ABI，Ni2+-NTA樹脂購自Novagen公司，電泳裝置購自BIO-RAD公司，熒光光度計購自Bio-TEK公司。DNA聚合酶、限制性內切酶、T4DNA連接酶均為Takara公司產品。PCR產物純化試劑盒、膠回收試劑盒，質粒提取試劑盒，底物Boc-lys(Ac)-AMC為Omega公司產品。

1.3 方法

1.3.1 Sir2基因的擴增和克隆 從Genebank中獲得結核分枝桿菌的Sir2(Rv1151c)基因的全核苷酸序列714 bp，使用Primer 5.0軟件設計引物擴增，上游引物：5′-TACTCCATGGTTATGCGAGTGGCGGTGCTCA-3′和下游引物：5′-ATTAGACTCCTATTTCAGCAGGGCGGGCA-3′。在上下游引物中分別引入酶切位點NcoⅠ和SacⅠ。PCR擴增循環條件為：95 ℃ 5 min，一個循環；95 ℃ 50 s，60 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min 30 s，進行30個循環反應；最后72 ℃延伸7 min。基因PCR擴增后瓊脂糖凝電泳回收目標條帶，膠回收后產物用NcoⅠ和SacⅠ雙酶切消化后與載體pET-28a進行連接，然后轉化入E.coli BL21得到E.coli BL21/pET-28a-Sir2，經過表達驗證、酶切驗證或PCR驗證后進行全基因測序。

1.3.2 Sir2的表達和純化 重組菌株在相應的抗菌藥物LB培養基中培養過夜后接種于新鮮的LB中，OD600為0.5時加入0.4 mmol/L的IPTG，18 ℃誘導10 h。利用Ni2+-NTA親和層析柱純化蛋白。SDS-PAGE檢測純度，濃度用Bio-Rad公司生產的蛋白質濃度測定。

1.3.3 Sir2依賴于NAD+的去乙酰化酶活性 本試驗利用乙酰化熒光底物Boc-lys(Ac)-AMC和NAD+作為反應底物測定依賴于NAD+的去乙酰化酶活性。測定酶活的反應體系組成：20 mmol/L Tris-HCl緩沖 (pH8.0)，200 mmol/L NaCl，50 mmol/L KH2PO4，250 mmol/L EDTA，500 μmol/L NAD+，20 μmol/L 熒光底物，20 μg His-Sir2重組酶，以不加入NAD+和不加入酶的反應作為陰性對照。進行酶反應條件優化，以獲得較佳的酶反應條件。反應混合物避光靜置，于一定恒溫反應2 h。終止反應：加入60 μg/mL胰蛋白酶，37 ℃保持30 min。然后使用酶標儀測定熒光值(激發光340;發射光460)。PZA抑制試驗：在上述反應體系內，加入梯度濃度的已知PZA。反應混合物避光靜置，于25 ℃恒溫反應2 h，然后加入終止緩沖液，于37 ℃反應30 min，測定熒光(激發光340;發射光460)。

2 結 果

2.1 結核分枝桿菌Sir2表達載體的構建與驗證 從結核分枝桿菌基因組中PCR擴增出全長714 bp的Sir2基因片段，通過基因工程連接到pET-28a載體中，酶切驗證后進行全基因測序，見電泳圖1。

注：泳道M，DNA Marker DL 2000 plus;泳道1，重組質粒pET-28a-Sir2;泳道2，重組質粒pET-28a-Sir2 NcoⅠ和SacⅠ雙酶切。

圖1 pET-28a-Sir2重組質粒的鑒定

2.2 結核分枝桿菌Sir2的表達及純化 對表達菌株E.coli BL21/pET-28a-Sir2先進行了Sir2蛋白表達條件的優化和可溶性分析，發現該蛋白在表達時形成大量包涵體。通過摸索發現，在0.4 mmol/L的IPTG，18 ℃誘導下，有利于形成可溶性蛋白，因此，采取該條件進行該蛋白的大量表達。經過特異親和層析，獲得純的Sir2蛋白見圖2，目的條帶約30×103。

2.3 Sir2依賴于NAD+的去乙酰化酶活性測定 首先用熒光法測Sir2蛋白依賴于NAD+的去乙酰化活性。結果顯示，陰性對照值熒光強度范圍在50左右，而添加了His-Sir2重組酶的熒光值在1 000左右，說明Sir2確實具有依賴于NAD+的去乙酰化活性。

注：泳道M，蛋白 Marker；泳道1，pET-28a菌株對照;泳道2，pET-28a-Sir2重組子；泳道3，純化的Sir2蛋白。

圖2 SDS-PAGE分析Sir2蛋白

2.3.1 最適合反應溫度和pH值 測定了不同溫度和pH條件下Sir2的去乙酰化酶活性。結果顯示，25 ℃下Sir2蛋白的酶活力最強，見圖3。最適pH值試驗表明，pH<7時隨著pH降低，酶活逐漸降低；pH>7時，隨著pH的升高，活力逐步加強，在pH 9左右達到頂峰，最適反應pH值為9，見圖4。

圖3 Sir2酶活最適反應溫度曲線

圖4 Sir2酶活最適反應pH值曲線

2.3.2 PZA抑制試驗 在偏酸性(pH5.5)環境和偏堿性環境(pH8.0)中測定不同濃度PZA對Sir2酶活的影響。在偏堿性條件PZA對Sir酶活沒有抑制效果；偏酸性條件，PZA表現出抑制活性，但抑制強度弱，600 μmol/L濃度下酶活力仍保持80%，且隨著濃度增大抑制效果增強不明顯。

3 討 論

Sir2蛋白是一類依賴于NAD+的去乙酰化酶，它的序列從原核生物到真核生物都很保守,但不同物種間Sir2蛋白還是會存在差異[11-12]。結核桿菌Sir2基因GC水平達到66.80%。外源表達條件下容易產生包涵體，這可能與大腸菌內缺乏輔助結核菌Sir2折疊的分子伴侶有關。本研究通過誘導條件的優化，最后在OD600為0.5時加入0.4 mmol/L的IPTG，18 ℃誘導10 h，蛋白可溶性提高，有利于蛋白質的純化和保持生物學功能。本研究證明了結核分枝桿菌Sir2蛋白是依賴于NAD+的去乙酰化酶，其活性對溫度和pH值是敏感的。37 ℃左右酶失去大部分活性，而37 ℃本是結核菌在人畜體內生存時的實際環境溫度，原因可能是體外反應條件不足以完全恢復其在體內的活力。

PZA是一種重要的抗結核菌藥物，對處于酸性環境中緩慢生長的吞噬細胞內的結核菌來說，PZA是目前最佳殺菌藥物。在體內它并非直接作用于病菌，而是依靠病菌自身的吡嗪酰胺酶將其活化成為吡嗪酸，才能起作用，但是其作用靶點至今不明確。本研究發現偏堿性條件PZA對Sir酶活沒有抑制效果；偏酸性條件，PZA表現出弱的抑制活性。

總之，本試驗構建了結核菌的原核表達載體并在大腸桿菌中誘導表達。通過優化誘導條件最后純化到該蛋白，試驗也證明了Sir2具有去乙酰化酶活性，最適反應溫度是25 ℃，pH9.0，偏酸性環境中PZA對其有較弱的抑制作用。本研究表明吡嗪酰胺的作用機制可能與Sir2有關。

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Study on cloning and enzymology of deacetylase protein Sir2 from Mycobacterium tuberculosis H37Rv

LINYa-ning,DONGJian,XUZhong-yu

(DepartmentofClinicalLaboratory,175HospitalofPLA/AffiliatedDongnanHospitalofXiamenUniversity,Zhangzhou,Fujian363000,China)

Objective To construct the deacetylase protein Sir2 prokaryotic expression vector of Mycobacterium tuberculosis(MTb) and to conduct the expression purification and enzymologic study.Methods Sir2 gene was amplified from MTb H37Rv genomic DNA as the template by PCR and then the recombinant plasmid pET-28a-Sir2 was constructed.The expression protein was induced in E.coli BL2(DE3) and purified by Ni2+-NTA afinity chromatography.Finally the optimal reaction temperature and pH value of Sir2,and influence of pyrazinamide(PZA) on enzyme activity were detected by the acetylation enzyme test.Results Sir2 prokaryotic expression vector was successfully constructed and could be highly expressed in E.Coli BL21(DE3).Then the purified Sir protein was conducted the NAD+dependent deacetylation activity research.The obtained optimal pH was 9.0 and the optimal reaction temperature was 25 ℃.PZA had the inhibition effect to the Sir2 enzymatic activity under weakly acidic environment,but without the inhibiting effect under the basic pH environment.Conclusion The highly purified protein is obtained by using themolecular cloning technique,the optimal pH and optimal reaction temperature are also obtained,PZA has the inhibiting effect on it,which provides certain foundation for researching the antibacterial mechanism of ant-tuberculous drug PZA.

mycobacterial; deacetylase; gene clone; expression and purification; PZA

林雅寧，女，碩士，技師，主要研究免疫學和臨床檢驗方面的研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.18.021

A

1672-9455(2015)18-2703-02

2015-04-11

2015-05-15)