石斛合劑調(diào)控老年糖尿病大鼠GLP-1的研究*

劉 赟，施 紅，林心君，鄭曉玲，許 茜

（福建中醫(yī)藥大學(xué)，福州 350122）

胰高血糖素樣多肽-1（GLP-1）是在回腸與結(jié)腸的L細(xì)胞產(chǎn)生的一種腸促胰素，其受體分布在胰島α、β細(xì)胞、周圍神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸道和心、腎、肺等重要器官[1]。GLP-1除了能抑制β細(xì)胞凋亡以外，還能促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖和再生，促進(jìn)胰島素，胰高血糖素的分泌等[2-3]。因此其在治療糖尿病（DM）的領(lǐng)域越來越引起人們的重視。本研究通過測定不同時(shí)間段血清GLP-1的濃度，探討石斛合劑（DC）通過調(diào)控GLP-1治療DM的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 雌性Wistar大鼠,SPF級(jí)，67只，體質(zhì)量（220±30）g。

1.2 藥物 石斛合劑藥物組成：石斛、黃芪、五味子、丹參、葛根、玄參等。低、高劑量生藥含量分別為：2、4 g/mL，滅菌后100 mL分裝1瓶，分裝保存?zhèn)溆谩６纂p胍緩釋片配制濃度：5 g/L，備用。

1.3 試劑 烏拉坦（氨基甲酸乙酯），大鼠GLP-1測定試劑盒等。

1.4 造模方法，實(shí)驗(yàn)分組及給藥

1.4.1 造模 適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后，將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為兩組:正常組13只、造模組54只。根據(jù)前期研究,正常組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，造模組給予高脂高糖飼料。1 a后，造模組按20 mg/kg腹腔注射鏈脲菌素（STZ）。3 d后篩出成模大鼠（血糖≥16.7 mmol/L），剩余大鼠再次腹腔注射STZ、檢測血糖，選出成模大鼠。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)將成模大鼠分為正常組（13只）、模型組（15只）、DC低劑量組（14只）、DC高劑量組（12只）、對照組（13只）。正常組、模型組予生理鹽水灌胃，對照組予二甲雙胍50 mg/（kg·d）灌胃，DC低、高劑量組按生藥量分別予DC 12 g/（kg·d）、24 g/（kg·d）灌胃，24 d后取材。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法 大鼠剪尾，酶聯(lián)免疫吸附法（ELASA法）檢測大鼠0.5、2.5 h血清GLP-1。處死，取小腸，免疫組化方法檢測大鼠小腸GLP-1。

2 結(jié)果

2.1 石斛合劑對糖耐量實(shí)驗(yàn)后0.5、2.5 h大鼠血清GLP-1水平及其差值的影響 見表1。

通過監(jiān)測糖耐量實(shí)驗(yàn)后0.5 h以及2.5 h GLP-1水平發(fā)現(xiàn)，0.5 h GLP－1結(jié)果顯示：與模型組比較，DC低劑量組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），DC高劑量組顯著高于模型組（P＜0.01）。2.5 h GLP-1結(jié)果顯示:與模型組比較，DC低劑量組、DC高劑量組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。0.5 h與2.5 h GLP-1水平的差值比較：與模型組比較，DC低劑量組低于模型組（P＜0.05），DC 高劑量組顯著高于模型組（P＜0.01）。

表1 糖耐量實(shí)驗(yàn)后0.5、2.5 h大鼠血清GLP-1水平及差值的比較（s）pmol/L

表1 糖耐量實(shí)驗(yàn)后0.5、2.5 h大鼠血清GLP-1水平及差值的比較（s）pmol/L

注:與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

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2.2 石斛合劑對大鼠GLP-1水平的影響 見圖1。

圖1 小腸GLP-1免疫組化圖片(×200)

通過觀察小腸GLP-1免疫組化圖片發(fā)現(xiàn)，正常組、模型組、對照組、DC低劑量組、DC高劑量組都未見陽性表達(dá)。正常組小腸腸上皮排列整齊，腸腺未見陽性表達(dá)，腸絨毛固有層可見部分黃褐色，為血液污染；模型組小腸固有層內(nèi)空泡明顯增多，腸腺未見陽性表達(dá)，腸絨毛固有層可見部分黃褐色，為血液污染；對照組、DC高、低劑量組小腸固有層內(nèi)空泡較正常組有所增多，腸腺未見陽性表達(dá)，腸絨毛固有層可見部分黃褐色，為血液污染。

3 討論

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活方式的改變，糖尿病的患病率呈上升趨勢，成為危害人類健康的全球性問題。中醫(yī)認(rèn)為2型糖尿病病位在脾（胃）、肝、腎為主，涉及心肺，陰虛或氣陰兩虛為本，痰濁血瘀為標(biāo)，多虛實(shí)夾雜[4-6]。初期為情志失調(diào)，痰濁化熱傷陰，以標(biāo)實(shí)為主。繼之為氣陰兩虛，最后陰陽兩虛，兼夾痰濁瘀血，以本虛為主[7-9]。基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，石斛合劑基礎(chǔ)方能使細(xì)胞內(nèi)溶酶體活性增強(qiáng)，自噬途徑的胞內(nèi)降解增加，從而使高血糖大鼠模型肝、腎的自噬表達(dá)增強(qiáng)[10]。另外，細(xì)胞培養(yǎng)顯示含石斛合劑基礎(chǔ)方的血清能保護(hù)胰島細(xì)胞并減輕STZ對胰島細(xì)胞的損傷[11]。還有報(bào)道表明石斛合劑能促進(jìn)GLP-1、胰島素分泌，抑制胰高血糖素分泌，逆轉(zhuǎn)糖尿病動(dòng)物延遲的血糖高峰、改善胰腺等組織結(jié)構(gòu)，改善糖脂代謝的作用，能抑制胰腺凋亡相關(guān)基因P53、Bax mRNA及蛋白表達(dá)等作用[12-14]。

本實(shí)驗(yàn)采用石斛合劑對大鼠進(jìn)行近1個(gè)月的治療發(fā)現(xiàn)，通過監(jiān)測糖耐量實(shí)驗(yàn)后0.5 h以及2.5 h GLP-1水平發(fā)現(xiàn)，0.5 h GLP－1結(jié)果顯示：與模型組比較，DC低劑量組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），DC高劑量組顯著高于模型組（P＜0.01）。2.5 h GLP-1結(jié)果顯示:與模型組比較，DC低劑量組、DC高劑量組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。0.5 h與2.5 h GLP-1水平的差值比較：與模型組比較，DC低劑量組低于模型組（P＜0.05），DC 高劑量組顯著高于模型組（P＜0.01）。通過觀察小腸GLP-1免疫組化圖片發(fā)現(xiàn)，正常組、模型組、對照組、DC低劑量組、DC高劑量組都未見陽性表達(dá)。正常組小腸腸上皮排列整齊，腸腺未見陽性表達(dá)，腸絨毛固有層可見部分黃褐色，為血液污染；模型組小腸固有層內(nèi)空泡明顯增多，腸腺未見陽性表達(dá)，腸絨毛固有層可見部分黃褐色，為血液污染；對照組、DC高、低劑量組小腸固有層內(nèi)空泡較正常組有所增多，腸腺未見陽性表達(dá)，腸絨毛固有層可見部分黃褐色，為血液污染。未發(fā)現(xiàn)GLP-1陽性表達(dá)的原因可能是因?yàn)镚LP-1在體內(nèi)的代謝比較快，半衰期僅1～2 min，故用免疫組化的方法比較難檢測出。

綜上所述，低劑量DC組雖然不能使大鼠0.5 h及2.5 h GLP-1水平顯著提高，但是通過比較這兩個(gè)時(shí)間段GLP-1水平，發(fā)現(xiàn)GLP-1水平下降很少，與模型組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；而高劑量DC組能使大鼠0.5 h GLP-1水平顯著提高，與模型組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。DC低劑量組呈現(xiàn)減少GLP-1降解，而DC高劑量組則更多呈現(xiàn)促進(jìn)GLP-1分泌，說明低劑量DC可能是通過在一定時(shí)間內(nèi)，抑制雌性SD大鼠體內(nèi)GLP-1降解而達(dá)到降血糖的作用；高劑量DC則可能是通過增加GLP-1水平而達(dá)到降血糖的目的。

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