血栓通及單體成分人參皂苷Rd對(duì)內(nèi)毒素激活小膠質(zhì)細(xì)胞的影響*

楊紅云，劉曉雷，柴麗娟，王少峽，胡利民

血栓通及單體成分人參皂苷Rd對(duì)內(nèi)毒素激活小膠質(zhì)細(xì)胞的影響*

楊紅云，劉曉雷，柴麗娟，王少峽，胡利民

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津市中藥藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，教育部方劑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300193）

［目的］研究血栓通及其單體成分對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞（BV-2）的影響及其作用機(jī)制。［方法］實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、脂多糖刺激組、加藥組和陽(yáng)性藥米諾環(huán)素組，CCK-8檢測(cè)血栓通（不同稀釋倍數(shù)的血栓通及其單體成分）對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響；Greiss法檢測(cè)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞一氧化氮（NO）產(chǎn)生的影響，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)炎性基因的表達(dá)。［結(jié)果］血栓通在0.5～50 mg/L范圍內(nèi)對(duì)LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞NO的產(chǎn)生沒有抑制作用；在血栓通5種單體成分中，人參皂苷Rg1、Rb1、Re、三七皂苷對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞NO的產(chǎn)生沒有抑制作用；人參皂苷Rd在不影響細(xì)胞活力的情況下能明顯抑制NO產(chǎn)生，并且能抑制炎癥基因誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）及白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）mRNA的表達(dá)。［結(jié)論］血栓通單體成分人參皂苷Rd抑制激活的小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生NO和iNOS、IL-1β、IL-6 mRNA的表達(dá)可能是血栓通發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

血栓通；一氧化氮；炎性介質(zhì)；小膠質(zhì)細(xì)胞

小膠質(zhì)細(xì)胞是一種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的第一道，更是最主要的免疫防線，主要功能是清除中樞神經(jīng)系統(tǒng)中損壞的神經(jīng)、斑塊及感染性物質(zhì)。因此腦缺血、神經(jīng)退行性疾病、感染等引起的許多微環(huán)境因子變化可迅速使小膠質(zhì)細(xì)胞活化。活化的小膠質(zhì)細(xì)胞能顯著上調(diào)許多細(xì)胞因子的分泌水平，能夠通過產(chǎn)生抗炎作用而促進(jìn)神經(jīng)元的存活；而大部分為一氧化氮（NO）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素等細(xì)胞毒性物質(zhì)能直接損傷神經(jīng)元或引起其他繼發(fā)性損傷。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）是合成NO的重要酶類，iNOS對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響是通過NO的作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的［1］。NO是內(nèi)源性血管舒張因子的主要活性成分［2］，能引起血管擴(kuò)張，增加血流量，參與機(jī)體生理調(diào)節(jié)，具有促細(xì)胞凋亡和抗細(xì)胞凋亡的雙重特性，其促凋亡和抗凋亡的作用很大程度上依賴于量的多少和及其發(fā)揮作用的細(xì)胞類型［3］。現(xiàn)階段治療和緩解神經(jīng)退行性疾病和腦損傷的重要手段，是抑制活化的小膠質(zhì)細(xì)胞所引發(fā)的炎癥反應(yīng)［4-5］。中風(fēng)后通過減弱血腦屏障的通透性和減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活性而達(dá)到保護(hù)腦組織的目的［6］。因此調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)作為神經(jīng)保護(hù)的方案略受到越來(lái)越多的關(guān)注。

血栓通的主要成分為三七總皂苷，三七總皂苷具有耐缺氧、改善微循環(huán)、增加機(jī)體免疫力、抗炎、抗衰老等多方面的生理活性［7］，特別是它具有較強(qiáng)的抗氧化作用，直接清除氧自由基的作用［8］，并且能減輕腦水腫，改善血腦屏障通透性［9］。因此在很多領(lǐng)域都得到了廣泛應(yīng)用，主要應(yīng)用在心腦血管系統(tǒng)疾病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病［10］，對(duì)腦血管繼發(fā)性損傷有保護(hù)作用，能有效抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡有抑制作用［11］，但其作用機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)采用脂多糖（LPS）激活小膠質(zhì)細(xì)胞，考察注射用血栓通抗神經(jīng)炎癥的作用及機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料與試劑小膠質(zhì)細(xì)胞株BV-2（北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院），注射用血栓通（吉林敖東股份有限公司），血栓通單體成分人參皂苷Rg1、Rb1、Re、Rd及三七皂苷（中新藥業(yè)）。胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco，美國(guó)）；T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，96孔、48孔、12孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning），NO檢測(cè)試劑盒（碧云天），Cell Counting Kit-8（CCK-8，北京同仁化學(xué)）；LPS（碧云天），二氧化碳（CO2）恒溫培養(yǎng)箱（THERMO，F(xiàn)ORMA3111型，美國(guó)），倒置相差顯微鏡（Nikon，TE200，日本），低溫高速離心機(jī)（BECKMAN，64R型，美國(guó)），實(shí)時(shí)定量PCR儀（ABI，7500型，美國(guó)），DU-800紫外分光光度計(jì)（DNA/Protein Analyzer，BECKMAN，美國(guó)），PCR1000（BIO RAD，日本），Trizol（invitrogen）。

1.2BV-2小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞株的培養(yǎng)37℃水浴復(fù)蘇細(xì)胞，接種于corning T25培養(yǎng)瓶中，放于孵箱中培養(yǎng)［5%CO2、95%氮?dú)猓∟2）、37℃飽和濕度］，待細(xì)胞融合后用胰蛋白酶消化種板。

1.3血栓通及單體對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響待細(xì)胞匯合后胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度至4×105個(gè)/mL，接種于96孔板，每孔加液量為0.1 mL，培養(yǎng)過夜，將細(xì)胞完全培養(yǎng)液替換為含有血栓通（終濃度分別為50 mg/L）及其單體成分的（10 μmol/L）基礎(chǔ)培養(yǎng)液孵育24 h，棄去上清，加入用基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制的CCK-8（終濃度V/V1∶10）繼續(xù)孵育0.5h后于450 nm處讀取吸光度值。

1.4血栓通及其單體對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞NO產(chǎn)生的影響待細(xì)胞匯合后胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞的濃度為4×105個(gè)/mL，接種到48孔板，每孔加液量為0.4 mL，培養(yǎng)過夜，將細(xì)胞完全培養(yǎng)液替換為含有不同濃度的血栓通（終濃度分別為50、5、0.5 mg/L）和血栓通單體成分（終濃度10 μmol/L）的基礎(chǔ)培養(yǎng)液預(yù)孵0.5 h，后加入LPS（終濃度0.1 mg/L）刺激，繼續(xù)培養(yǎng)24h后吸取50μL細(xì)胞上清，Greiss法檢測(cè)NO濃度。

1.5人參皂苷Rd對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞iNOS、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)的影響待細(xì)胞匯合后胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度至4×105個(gè)/mL，接種到12孔板，每孔加液量為2.5 mL，培養(yǎng)過夜，將細(xì)胞完全培養(yǎng)液替換為含有血栓通單體成分（終濃度10 μmol/L）的基礎(chǔ)培養(yǎng)基預(yù)孵0.5h，然后加入LPS（0.1mg/L）刺激，37℃孵育8 h后提取總核糖核酸（RNA）。用DU800檢測(cè)RNA濃度及A260/A2801.5μgRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA（20μL體系）。取1μL的cDNA產(chǎn)物作為模板加入炎癥基因引物進(jìn)行擴(kuò)增，看家基因GAPDH作為內(nèi)參。數(shù)據(jù)采用2-△△CT相對(duì)定量法分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異性比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較，若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett’s T3法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2．1CCK-8檢測(cè)血栓通對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響與對(duì)照組相比，陽(yáng)性藥米諾環(huán)素組、血栓通組（50 mg/L）細(xì)胞活力沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明米諾環(huán)素、血栓通（50 mg/L）均沒有細(xì)胞毒作用。見表1。

表1　血栓通對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響

表1　血栓通對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響

注：結(jié)果重復(fù)3次，趨勢(shì)一致。

組別對(duì)照組血栓通組米諾環(huán)素組n 6 6 6 1.261 0±0.077 2 50 mg/L00　1.361 2±0.041 2 10 μmol/L　1.381 6±0.101 5濃度　吸光度-

2.2Greiss法檢測(cè)血栓通對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌NO的影響與對(duì)照組相比，LPS組能顯著增加NO的釋放，與LPS組相比，陽(yáng)性對(duì)照組米諾環(huán)素能明顯抑制NO的釋放，血栓通（0.5～50 mg/L）不能抑制NO的釋放。見表2。

表2　血栓通對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞NO的影響

表2　血栓通對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞NO的影響

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與LPS組比較，##P＜0.01。結(jié)果重復(fù)3次，趨勢(shì)一致。

組別對(duì)照組LPS組血栓通組米諾環(huán)素組n 6 6 6　6濃度　NO濃度（μmol/L）-0-1.326 8±0.241 3 00.1 mg/L　015.919 3±1.090 1** 50.0 mg/L　013.062 1±1.154 9 05.0 mg/L　014.184 6±1.701 1 00.5 mg/L　015.142 2±0.536 5 0010.0 μmol/L　005.387 3±0.444 5##

2.3CCK-8檢測(cè)血栓通單體對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響與對(duì)照組相比，人參皂苷Rd、Rg1、Rb1、Re，三七皂苷組細(xì)胞活力均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明這5種單體成分無(wú)細(xì)胞毒作用。見表3。

表3　血栓通單體成分對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響

表3　血栓通單體成分對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響

注：結(jié)果重復(fù)3次，趨勢(shì)一致。

組別對(duì)照組人參皂苷Rd人參皂苷Rg1人參皂苷Rb1人參皂苷Re三七皂苷組n 6 6 6 6 6 6濃度（μmol/L）　吸光度-1.167±0.057 1 10　1.219±0.066 3 10　1.222±0.078 8 10　1.187±0.057 8 10　1.193±0.055 9 10　1.137±0.062 7

2.4Greiss法檢測(cè)血栓通單體成分對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌NO的影響與對(duì)照組相比，LPS組能顯著增加NO的釋放。與LPS組相比，人參皂苷Rd在無(wú)細(xì)胞毒的情況下能明顯抑制NO的釋放，人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、三七皂苷對(duì)NO無(wú)明顯抑制作用。見表4。

表4　血栓通單體成分對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌NO的影響μmol/L

表4　血栓通單體成分對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌NO的影響μmol/L

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與LPS組比較，##P＜0.01。結(jié)果重復(fù)3次，趨勢(shì)一致。

組別對(duì)照組LPS組人參皂苷Rd n 6 6 6 6 6 6 6 -1.071 9±0.223 6 00.0.1　12.513 1±1.543 0** 10　8.656 9±1.464 4##濃度　NO濃度-人參皂苷Rg1人參皂苷Rb1 10　12.464 1±0.439 1 10　10.705 9±0.458 9人參皂苷Re三七皂苷10　11.990 2±0.539 4 10　12.977 1±2.324 8

2.5人參皂苷Rd對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞iNOS、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）mRNA表達(dá)的影響與對(duì)照組相比，LPS組能明顯提高iNOS、IL-1β、IL-6 mRNA的表達(dá)；與LPS組比較，人參皂苷Rd能顯著抑制iNOS、IL-1β、IL-6 mRNA的表達(dá)。見表5。

表5　人參皂苷Rd對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞iNOS、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)的影響μmol/L

表5　人參皂苷Rd對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞iNOS、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)的影響μmol/L

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與LPS組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。結(jié)果重復(fù)3次，趨勢(shì)一致。

組別　iNOS　IL-1β　IL-6對(duì)照組　1.048±0.403　1 711.006±290.135　1.049±000.415 LPS組　32.451±2.366**1 718.022±294.243**6 465.623±837.678**人參皂苷Rd　11.293±0.390##1 241.609±302.286#1 118.268±115.271##n 6 6 6濃度-0.1 mg/L 10 μmol/L

3　討論

血栓通0.5～50 mg/L范圍內(nèi)對(duì)LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞NO的產(chǎn)生沒有抑制作用，在血栓通5種單體成分中，人參皂苷Rd可以在不影響細(xì)胞活力的情況下抑制NO產(chǎn)生，同時(shí)能顯著抑制iNOS、IL-1β、IL-6 mRNA等炎癥基因的表達(dá)。

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞，具有免疫防御和炎癥反應(yīng)［12］。活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可合成和分泌一系列細(xì)胞因子、蛋白質(zhì)或其他生物活性分子，這些物質(zhì)中某些發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，某些可產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元死亡［13-14］。

小膠質(zhì)細(xì)胞受到刺激后迅速激活，其形態(tài)功能發(fā)生明顯改變。抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化可以減輕腦內(nèi)繼發(fā)性損傷，同時(shí)使受損的組織和細(xì)胞得到修復(fù)。研究表明，血栓通單體成分人參皂苷Rd在不影響細(xì)胞活力的前提下，能明顯抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化釋放NO、抑制多數(shù)炎癥基因mRNA的表達(dá)。因此，血栓通可能是通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化減少炎癥介質(zhì)的釋放來(lái)發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制之一。

［1］王秀云，李積勝，朱虹，等.不同劑量補(bǔ)鋅對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能及海馬一氧化氮合酶活性的影響［J］.天津中醫(yī)藥，2006，23（1）:54-56.

［2］呂炳強(qiáng)，姜希娟，趙桂峰，等.救心膠囊對(duì)損傷內(nèi)皮細(xì)胞NO和ET-1釋放的影響［J］.天津中醫(yī)藥，2004，21（4）：322-324.

［3］康健，劉椏，謝春光，等.參芪復(fù)方對(duì)GK大鼠心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax及NO的影響［J］.天津中醫(yī)藥，2009，26（6）：489-492.

［4］Giovannini MG，Scali C，Prosperi C，et al.Beta-amyloidinduced inflammation and cholinergic hypofunction in the rat brain in vivo:involvement of the p38MAPK pathway［J］. Neurobiology of disease，2002，11（2）:257-274.

［5］van Rossum D，Hanisch UK.Microglia［J］.Metabolic Brain Disease，2004，19（3-4）:393-411.

［6］Jin R，Yu SY，Song ZF，et al.Phosphoinositide 3-kinasegamma expression is upregulated in brain microglia and contributes to ischemia-induced microglial activation in acute experimental stroke［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2010，399（3）:458-464.

［7］陳英.三七總皂苷的藥理研究及臨床應(yīng)用進(jìn)展［J］.廣西醫(yī)學(xué)，1998，20（6）:1109-1112.

［8］雷秀玲，董雪峰，陳植和，等.絡(luò)泰對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性急性心肌缺血的保護(hù)作用及抗脂質(zhì)過氧化作用［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2001，13（4）:58-61.

［9］Liu JH.Effect of PNS on brain blood flowing and brainblood barrier with cerebral ischem ial［J］.Apoplexy and Nervous disease，2002，19（3）:164-165.

［10］張劍峰，張丹參.三七總皂苷藥理作用研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2007，13（6）:472-474.

［11］胡志潔，張志耘.三七總皂苷對(duì)心腦血管的藥理作用研究［J］.天津藥學(xué)，2006，18（6）:51-55.

［12］Li J，Zhang SY，Lu MR.Hydroxysafflor yellow A suppresses inflammatoryresponses of BV2 microglia after oxygenglucose deprivation［J］.Neuroscience Letters，2013，535：51-56.

［13］景浩然，柴麗娟，郭虹，等.大黃酸對(duì)內(nèi)毒素激活小膠質(zhì)細(xì)胞的影響［J］.天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，31（1）:34-35.

［14］Ladecola C，Anrather J.The immunology of stroke:from mechanisms to translation［J］.Nature Medcine，2011，17（7）: 796.

Effect of Xueshuantong and Ginsenoside Rd on lipopolysaccharides actived microglia cells

YANG Hong-yun，LIU Xiao-lei，CHAI Li-juan，WANG Shao-xia，HU Li-min
（Key Laboratory of Pharmacology of Traditional Chinese Medical Formulae，Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory of Chinese medicine Pharmacology，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To study the effects of Xueshuantong and its monomer on actived microglia（BV-2）and its mechanism.［Methods］The experiment was divided into control group，lipopolysaccharide（LPS）group，dosing group and positive control group（mino），detecting of Xueshuantong（different dilution multiples of Xueshuantong and its monomer composition）to the vitality of microglia and nitric oxide（NO）induced by LPS using the Greiss method.［Results］Between 0.5～50 μg/mL，Xueshuantong could not inhibit the microglia release NO induced by LPS，among the 5 kinds of monomer composition of Xueshuantong，ginsenoside Rg1，Rb1，Re and Notoginsenoside could not inhibit the microglia release NO induced by LPS，however，ginsenoside Rd could inhibit NO secretion without affecting the cell vitality，and inhibit the mRNA expression of iNOS，IL-1β，IL-6.［Conclusion］The monomer composition of ginsenoside Rd in Xueshuangtong can inhibit activated microglia release NO and the mRNA of iNOS，IL-1β，IL-6 significantly.It may be one of neural protection mechanism.

Xueshuantong；nitric oxide；inflammatory mediator；microglia

R285.5

A

1673-9043（2015）06-0342-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.12.07

國(guó)家重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目資助（2012ZX09101201-004）。

楊紅云（1987-），女，碩士研究生，主要從事神經(jīng)藥理學(xué)研究。

王少峽，E-mail:wangshaoxia1978@hotmail.com。

（2015-07-13）