左歸降糖益腎方含藥血漿對高糖培養小鼠足細胞podocin及nephrin表達的影響*

陳　聰，印紅愛，喻　嶸，曾　婧，唐　元，羅文娟，張　翔，成細華

·實驗研究·

左歸降糖益腎方含藥血漿對高糖培養小鼠足細胞podocin及nephrin表達的影響*

陳聰，印紅愛，喻嶸，曾婧，唐元，羅文娟，張翔，成細華

（湖南中醫藥大學，長沙410208）

［目的］探討在高糖作用下，體外培養的小鼠足細胞podocin及nephrin表達水平的變化，及左歸降糖益腎方含藥血漿的調控作用。［方法］將體外培養的小鼠足細胞隨機分為空白組（A組）、高糖組（B組）、左歸降糖益腎方含藥血漿組（C組）、4-苯基丁酸含藥血漿組（D組）。采用間接免疫熒光細胞化學法鑒定足細胞podocin及nephrin蛋白的表達；噻唑藍（MTT）自動比色法檢測足細胞活力，蛋白質印跡法，逆轉錄-聚合酶鏈反應法分別檢測podocin及nephrin蛋白或mRNA表達水平的變化。［結果］與A組相比，B組足細胞活力，podocin及nephrin蛋白或mRNA的表達水平均降低（P＜0.01）；與B組相比，C組、D組足細胞活力，podocin及nephrin蛋白或mRNA的表達水平均升高（P＜0.01）；與C組相比，D組足細胞活力升高（P＜0.05）。［結論］podocin及nephrin蛋白或mRNA表達水平的降低，是足細胞損傷的分子機制之一；左歸降糖益腎方含藥血漿可以通過升高podocin及nephrin蛋白或mRNA的表達水平，從而保護足細胞。

左歸降糖益腎方；高糖；足細胞；Podocin；Nephrin

足細胞位于腎小球基底膜外側，是終末分化的上皮細胞，幾乎沒有再生能力，是腎小球濾過的最后一道屏障。足細胞的損傷和剝脫，與糖尿病腎病（DN）早期發病相關［1-3］。podocin及nephrin是足細胞裂孔膜跨膜蛋白分子，其結構與功能的改變參與了DN的發生、發展［4-5］。高糖環境是引起足細胞損傷及（或）死亡的原因之一，其具體分子機制尚不清楚。左歸降糖益腎方含熟地黃、黃芪、山藥等9味藥，課題組前期研究發現其可改善糖尿病腎病MKR鼠腎功能，保護足細胞結構［6］。在前期研究基礎上，本文進一步探討左歸降糖益腎方含藥血漿對高糖誘導足細胞損傷的調控作用和部分可能分子機制，為糖尿病腎病的靶向治療提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞小鼠足細胞購自北京協和細胞中心（Mouse podocyte；3111C0001CCC000230）。以含10%胎牛血清，90%的DMEM完全培養基（含100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、25 mmol/L葡萄糖）在細胞培養室5%二氧化碳（CO2），37℃培養箱中培養。期間2～3 d更換培養液1次，相差顯微鏡觀察細胞形態，待細胞體積明顯增大，向四周伸出足突分化成熟后用于實驗。實驗場地主要由湖南中醫藥大學醫學基礎教學實驗中心提供。

1.1.2主要試劑總RNA提取試劑盒，購自天根生化科技有限公司，批號DP431。逆轉錄試劑盒，購自Fermentas公司，批號#K1622。PCR引物，由上海生工公司合成。Rabbit nephrin antibody購自Abcam公司，批號ab58968。Rabbit podocin antibody購自SANTA公司，批號SC-21009。Mouse GAPDH antibody購自SANTA公司，批號SC-365062。葡萄糖（分析純），購自上海國藥集團化學試劑有限公司，批號10010518。Alexa Fluor?488標記山羊抗兔IgG（重鏈+輕鏈）二抗，購自北京中杉金橋生物技術有限公司，批號ZF-0511。

1.1.3主要儀器TG16W型臺式離心機，購自長沙平凡儀器儀表有限公司。DCW-3510節能型智能恒溫槽，購自寧波新芝生物科技股份有限公司。WD-9402 A型PCR擴增儀，購自北京六一儀器廠。F1-F2 Fuses Type T2A型化學發光凝膠成像分析系統，購自Bio-Rad公司。BioPhotometer plus型核酸蛋白分析儀，購自Eppendorf公司。AE 31型倒置熒光顯微鏡，購自Motic公司。

1.1.4含藥血漿制備左歸降糖益腎方：由熟地黃、黃芪、山藥等9味藥組成（中藥湯劑制備：經水煎煮2次，混合過濾后，濃縮制備成含生藥濃度為2 g/mL的藥液，經滅菌后置4℃冰箱中備用）。君藥熟地黃為玄參科地黃（Rehmannia glutinosa Libosch.）干燥塊根的炮制加工品（酒燉或蒸法），黃芪為豆科植物蒙古黃芪［Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge. var.mongholicus（Bge.）Hsiao］的干燥根，經湖南中醫藥大學第一附屬醫院王宇紅教授鑒定均為正品。Wistar大鼠40只，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，飼養于湖南中醫藥大學SPF級實驗動物中心，許可證號：SYXK（湘）2013-0005。按隨機數字表法隨機分為4組，每組10只。采用連續7 d，3倍量給藥，每日1次。按人與大鼠體表面積換算法計算給藥量，中藥給藥劑量為30 g/kg，灌胃給藥容量為15mL/kg；內質網應激分子伴侶4-苯基丁酸（4-PBA），生理鹽水稀釋，濃度為0.20 g/mL，劑量為3 g/kg，灌胃給藥容量為15 mL/kg；空白血漿采用相同動物不給藥同法收集。末次給藥后1h腹主動脈插管取血，EDTA抗凝，收集血漿0.22 μm濾膜過濾，56℃水浴滅活30 min后，分裝置-20℃冰箱備用。

1.2方法用完全培養基調細胞密度為1×105/mL的細胞懸液，然后轉種培養瓶中，加入完全培養基總體積5 mL，放入CO2培養箱中培養至貼壁。用不含胎牛血清的DMEM培養液同步化處理12 h后，分為空白組（A組，10%空白血漿的DMEM培養基，終濃度25 mmol/L葡萄糖），高糖組（B組，含10%空白血漿的DMEM培養基，終濃度200 mmol/L葡萄糖），左歸降糖益腎方含藥血漿組（C組，10%含藥血漿的DMEM培養基，終濃度200 mmol/L葡萄糖），4-PBA含藥血漿組（D組，10%含藥血漿的DMEM培養基，終濃度200 mmol/L葡萄糖）。根據課題組預實驗結果，選擇在48 h后收集細胞。用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化細胞，加入完全培養基終止消化，離心管收集細胞懸液，1 000 r/min，5 min離心，棄上清；用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞沉淀2～3次，1 000 r/min，5 min離心，棄上清；置冰上，用于Western blot，逆轉錄-聚合酶鏈反應等相關檢測。

1.2.1逆轉錄-聚合酶鏈反應用總RNA提取試劑盒抽提其總RNA，采用核酸蛋白分析儀測定其濃度。取1 μg總RNA，隨后用逆轉錄試劑盒以Oligo（dT）為引物進行逆轉錄反應。以GAPDH為內參基因。應用Primer 5.0軟件，根據GenBank中小鼠的序列設計引物。Podocin：上游5’-TGAGGATGGCGGCTGAGAT-3’，下游5’-GGTTTGGAGGAACTTGGGT-3’，產物大小193 bp。Nephrin：上游5’-CC CAACACTGGAAGAGGTGT-3’，下游5’-CTGGTCGTAGATTCCCCTTG-3’，產物大小211 bp。GAPDH：上游5’-ACTTGAAGGGTGGAGCCAAA-3’；下游5’-CCAGGAAATGAGCTTGACA-3’，產物大小608 bp。選擇最適條件分別對podocin、nephrin、GAPDH進行聚合酶鏈反應（PCR）擴增，PCR產物進行2.0%瓊脂糖凝膠電泳，Bio-Rad化學發光凝膠成像分析系統分析電泳條帶灰度值，分別以podocin，nephrin和GAPDH電泳條帶灰度值比值計算 podocin及nephrin mRNA相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.2.2蛋白質印跡法按試劑盒操作抽取總蛋白，取出已變性的蛋白樣品。每孔加40 μg蛋白樣品電泳，積層膠電壓80 V，分離膠電壓120 V。電泳結束后轉膜70 min，將轉有蛋白的膜置于5%牛血清白蛋白中封閉，37℃，1 h，置于1抗（nephrin、podocin 1抗分別用封閉液1∶500、1∶400稀釋，GAPDH內參按照1∶800稀釋）中孵育2h，PBST洗4次，每次10 min，分別加入2抗（1∶40 000或1∶80 000），室溫孵育1 h，PBST洗4次。將膜風干，貼在玻璃紙上，加底物，做化學發光，得到膠片。將背景較高的底片放入PIERCE公司X光片背景去除液中，觀察到理想的結果時，終止反應，用水清洗以去除不需要的背景。GAPDH蛋白為內參，目的條帶灰度值/同個樣品的GAPDH灰度值表示目的基因蛋白表達水平，實驗重復3次，取均值。

1.2.3間接免疫熒光細胞化學法在無菌狀態下，將防脫蓋玻片分別放入6孔培養板中。每孔均勻加入含細胞1×105/mL的完全培養基懸液1mL，放入CO2培養箱中培養至貼壁。用不含胎牛血清的DMEM培養基同步化處理12 h后，分為A組、B組、C組、D組。分別加入相應培養基，48 h后收集細胞，用PBS洗滌5min，3次，加入4%多聚甲醛固定（25～30min），PBS洗5～10 min，3次。用1%曲拉通X-100（PBS配制），2～5min，PBS洗5～10min，3次。3%雙氧水（H2O2）配制，室溫孵育10 min，PBS洗5～10 min，3次。分別加入兔抗小鼠 podocin及 nephrin多克隆一抗（1∶100，PBS稀釋），陰性對照以PBS代替一抗，過夜。PBS洗10 min，3次。加入Alexa Fluor?488標記山羊抗兔IgG二抗（1∶200，PBS稀釋，避光），37℃，40 min，PBS洗10 min，3次。晾干，抗熒光淬滅封片劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察，拍片。

1.2.4噻唑藍（MTT）自動比色法將細胞懸液接種于96孔培養板，每孔約10 000個，每組各5復孔，貼壁后，分別加入相應培養基，孵育48 h后，終止反應，吸除多余培養液，PBS洗2次后，每孔加入含MTT（0.5 mg/mL）的DMEM培養液（不含胎牛血清）150 μL，37℃繼續孵育4 h后，終止培養，吸棄廢液，不洗，每孔加入100 μL DMSO，避光置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀上570 nm波長檢測各孔吸光值。

1.2.5統計學處理數據滿足正態性及方差齊性檢驗，采用單因素方差分析；若不滿足，則采用非參數檢驗，P＜0.05有統計學意義。使用SPSS 17.0統計軟件處理，結果以均數±標準差表示。

2　結果

2.1足細胞的鑒定細胞接種12 h后見貼壁，24 h后見細胞突起長出，2～3 d細胞可達80%融合，足細胞呈星形伸出樹枝狀突起，相鄰細胞間形成相互連接。免疫熒光染色可見足細胞特異性蛋白podocin及nephrin表達陽性。見圖1。

圖1　足細胞podocin及nephrin蛋白的表達（免疫熒光染色×400）

2.2檢測結果與A組相比，B組足細胞活力，podocin及nephrin蛋白或mRNA的表達水平均降低（P＜0.01）；與B組相比，C組、D組足細胞活力，podocin及 nephrin蛋白或mRNA的表達水平均升高（P＜0.01）；與C組比較，D組足細胞活力升高（P＜0.05），但podocin及nephrin蛋白或mRNA的表達水平，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1、表2、圖2。

表1　左歸降糖益腎方含藥血漿對足細胞活力、podocin及nephrin mRNA表達水平的影響

表1　左歸降糖益腎方含藥血漿對足細胞活力、podocin及nephrin mRNA表達水平的影響

注：與A組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與B組比較，##P＜0.01；與C組比較，△P＜0.05。

組別A B C D n　3 3 3 3 nephrin mRNA/ GAPDH mRNA 0.66±0.05　0.85±0.03　0.61±0.04 0.43±0.01**　0.42±0.01**　0.29±0.08** 0.57±0.01##　0.50±0.01**##　0.45±0.02**##0.64±0.04#△　0.51±0.04**##　0.48±0.01*##A值　podocin mRNA/ GAPDH mRNA

表2　左歸降糖益腎方含藥血漿對足細胞podocin及nephrin蛋白表達水平的影響

表2　左歸降糖益腎方含藥血漿對足細胞podocin及nephrin蛋白表達水平的影響

注：與A組比較，**P＜0.01；與B組比較，##P＜0.01。

組別A B C D n 3 3 3 3 podocin/GAPDH　nephrin/GAPDH 0.75±0.03　0.96±0.03 0.33±0.01**　0.42±0.02** 0.53±0.02**##　0.63±0.02**##0.53±0.01**##　0.65±0.02**##

圖2　各組podocin和nephrin蛋白及mRNA的表達水平

3　討論

足細胞是糖尿病腎病的關鍵靶細胞之一，podocin、nephrin是足細胞特異性蛋白，是維持足細胞裂孔膜完整性的重要組成部分，對維持裂孔膜的結構完整與功能、足細胞正常形態附著和運動、介導上皮細胞與基質的相互作用從而影響腎小球基底膜的通透性和基質的沉積等具有重要的作用［4-5］。有研究發現DN患者足細胞podocin蛋白或nephrin蛋白表達降低，且表達減少與尿蛋白增加負相關［6-7］。

相關研究及本實驗進一步證實，nephrin和podocin分布方式相似，主要分布于胞質內，核膜及胞膜的表面，以胞膜的染色最深；在胞漿呈放射性沿著細胞骨架分布；且在細胞膜上呈連續性的線狀分布［8］。本實驗高糖200 mmol/L體外處理足細胞48 h后，發現與空白組葡萄糖組比：足細胞活力下降，podocin及nephrin蛋白或mRNA的表達水平降低（P＜0.05或P＜0.01）。證實高糖是造成足細胞損傷的原因之一；足細胞損傷的分子機制之一是podocin蛋白及mRNA的表達水平降低。左歸降糖益腎方含藥血漿治療后，足細胞podocin及nephrin蛋白或mRNA表達水平升高；提示左歸降糖益腎方含藥血漿可以通過升高podocin及nephrin蛋白或mRNA的表達水平，從而保護足細胞。

［1］Reddy GR，Kotlyarevska K，Ransom RF，et al.The podocyte and diabetes mellitus:is the podocyte the key to the origins of diabetic nephropathy［J］.Curr Opin Nephrol Hypertens，2008，17（1）:32-36.

［2］Gao P，Meng XF，Su H，et al.Thioredoxin-interacting protein mediates NALP3 inflammasome activation in podocytes during diabetic nephropathy［J］.Biochim Biophys Acta，2014，1843（11）:2448-2460.

［3］ Baelde HJ，Eikmans M，Lappin DW，et al.Reduction of VEGF-A and CTGF expression in diabetic nephropathy is associated with podocyte loss［J］.Kidney Int，2007，71（7）: 637-645.

［4］Kobayashi R，Kamiie J，Yasuno K，et al.Expression of Nephrin，Podocin，alpha-Actinin-4 and alpha 3-Integrin in CanineRenalGlomeruli［J］.Journalof Comparative Pathology，2011，145（2/3）:220-225.

［5］Saleem MA，O’Hare MJ，Reiser J.A conditionally immortalized human podocyte cell line demonstrating nephrin and podocin expression［J］.J Am Soc Nephrol，2002，13（3）:630-638.

［6］印紅愛，吳勇軍，喻嶸，等.左歸降糖益腎方對2型糖尿病腎病小鼠足細胞nephrin與podocin表達的影響［J］.中國中醫藥信息雜志，2014，21（3）:53-57.

［7］Doublier S，Salvidio G，Lupia E，et al.Nephrin expression is reduced in human diabetic nephropathy：evidence for a distinct role for glycated albumin and angiotensinⅡ［J］. Diabetes，2003，52（4）:1023-1030.

［8］范青鋒，丁潔，張敬京，等.Nephrin，podocin及αactinin在小鼠腎小球足細胞系的表達與分布［J］.腎臟病與透析腎移植雜志，2003，12（5）:407-411.

Effects of Zuogui Jiangtang Yishen decoction plasma on Podocin and Nephrin expressions in podocyte cells of high glucose condition in vitro

CHEN Cong，YIN Hong-ai，YU Rong，ZENG Jing，TANG Yuan，LUO Wen-juan，ZHANG Xiang，CHENG Xi-hua
（Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Changsha 410208，China）

［Objective］To investigate the levels of protein and mRNA expressions of podocin and nephrin in podocyte cells cultured in high glucose condition in vitro，and the effects of Zuogui Jiangtang Yishen decoction plasma on podocin and nephrin expressions in podocyte cells.［Methods］Cultured podocyte cells were divided into four groups：control group（A group），high glucose group（B group），Zuogui Jiangtang Yishen decoction plasma group（C group）and 4-Phenylbutyric acid group（D group）.After incubation for 48 h，the cell viability was detected by MTT colorimetry assay.The protein and mRNA expressions of Podocin and Nephrin were analyzed by western blot or reverse transcription-polymerase chain reaction respectively.［Results］Induced by high g1ucose，the viability of podocyte cells was significantly decreased of B group，and their expressions of Podocin and Nephrin protein or mRNA were downregulated，as compared with A group（P＜0.01）；as compared with B group，the expressions of Podocin and Nephrin protein or mRNA of podocyte cells of C group and D group were upregulated，and the viability of podocyte cells were significantly increased（P＜0.01）；and compared with C group，the cell viability was significantly increased of D group（P＜0.05）.［Conclusion］The lower level expressions of Podocin and Nephrin protein or mRNA were the molecular mechanisms of podocyte injury.ZJYD plasma can repair the damaged podocyte by upregulating Podocin and Nephrin protein or mRNA expressions.

Zuogui Jiangtang Yishen decoction plasma；high glucose；podocyte；Podocin；Nephrin

R285.5

A

1673-9043（2015）06-0338-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.12.06

國家自然科學基金面上項目（81273753）；湖南省自然科學基金（12JJ2048，12JJ9031）；湖南省研究生科研創新項目（CX2013B321）。

陳聰（1985-），女，博士研究生，研究方向為中醫藥防治糖尿病腎病的研究。

喻嶸，E-mail:yuron@21cn.com。

（2015-07-15）