新型伊立替康衍生物ZBH－1208的體外抗腫瘤活性及機制研究

趙 靜，于 鴻，吳 荻，史衛(wèi)國，仲伯華，劉 菁，張馨月，趙大瑋，王學林

（1.吉林大學動物醫(yī)學學院人獸共患病研究所人獸共患病研究教育部重點實驗室，吉林長春130062；

2.吉林省腫瘤防治研究所細胞生物研究室，吉林長春130012；3.吉林大學第一醫(yī)院腫瘤中心，吉林長春130021；

4.軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所，北京100850；5.中國科學院長春應用化學研究所，吉林長春130022；6.吉林省腫瘤醫(yī)院乳腺科，吉林長春130012）

新型伊立替康衍生物ZBH－1208的體外抗腫瘤活性及機制研究

趙 靜1＊，于 鴻2＊，吳 荻3，史衛(wèi)國4，仲伯華4，劉 菁1，張馨月5，趙大瑋6，王學林1

（1.吉林大學動物醫(yī)學學院人獸共患病研究所人獸共患病研究教育部重點實驗室，吉林長春130062；

2.吉林省腫瘤防治研究所細胞生物研究室，吉林長春130012；3.吉林大學第一醫(yī)院腫瘤中心，吉林長春130021；

4.軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所，北京100850；5.中國科學院長春應用化學研究所，吉林長春130022；6.吉林省腫瘤醫(yī)院乳腺科，吉林長春130012）

目的研究新型伊立替康衍生物ZBH－1208體外對腫瘤細胞的生長抑制作用并初步探討其作用機制。方法采用四甲基偶氮唑鹽比色（MTT）法檢測分析ZBH－1208對人宮頸癌HeLa細胞、人非小細胞肺癌A549細胞、人小細胞肺癌NCI－H446細胞、人乳腺癌MCF－7細胞、人結腸癌SW1116細胞、人胃腺癌SGC－7901細胞、人肝癌SMMC－7721細胞及人胚腎293細胞的生長抑制作用，計算IC50值；流式細胞術檢測ZBH－1208對腫瘤細胞周期及活化Caspase－3表達的影響。結果ZBH－1208對腫瘤細胞的生長具有抑制作用，呈劑量－時間依賴關系。ZBH－1208作用各腫瘤細胞后IC50值在0.002μmol／L－0.265μmol／L之間，而對照組伊立替康（CPT－11）的IC50值在0.464μmol／L－52.111μmol／L之間，兩者相比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。流式細胞術檢測結果顯示，ZBH－1208誘導腫瘤細胞發(fā)生G2／M期阻滯，百分比到達90%以上；并且誘導活化形式Caspase－3表達增加。結論與CPT－11相比，新型化合物ZBH－1208具有高效低毒、起效快的特點，可使腫瘤細胞發(fā)生細胞周期阻滯，并誘導腫瘤細胞凋亡，具有進一步研究開發(fā)的價值。

伊立替康；衍生物；細胞周期阻滯；細胞凋亡

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0181）

喜樹堿（Camptothecin，CPT）是美國化學家Wall ME和Wani MC在1966年首先從中國珙桐科植物喜樹（Camptothecaacμminata）中提取，對多種實體瘤具有治療作用的天然生物堿［1］。天然喜樹堿水溶性極差，限制了其開發(fā)應用。1983年日本Yakult和Painichi公司研制出水溶性好的喜樹堿類衍生物伊立替康（Irinotecan，CPT－11）。CPT－11是7－乙基－10－羥基喜樹堿（SN－38）的一種水溶性前藥，改善了喜樹堿水溶性差的問題，有利于喜樹堿的胃腸道吸收，臨床上用于治療結腸直腸癌、胃癌、宮頸癌、卵巢癌、肺癌和惡性淋巴瘤等惡性腫瘤［2］。然而，CPT－11在體內發(fā)揮作用時，必須由羧酸酯酶催化轉化為活性形式SN－38，其效率較低，而且CPT－11對乙酰膽堿酯酶（AchE）具有抑制作用，會引起嚴重的毒副作用，如腹瀉和骨髓抑制［3，4］。因此，此類型喜樹堿前藥有待進行進一步研究開發(fā)。近年來國內外已報道多種新型改構化合物，可以克服伊立替康的缺陷，降低毒副反應，提高藥物療效［5－9］。本研究通過分析喜樹堿類衍生物的構效關系和選擇合適的載體，對其進行結構改造與修飾，合成了一系列新型伊立替康衍生物。初步的體外實驗已表明，新型化合物具有高于伊立替康的體外抗腫瘤作用，可以更快的水解為SN－38或以SN－38為母體、水溶性高并能克服伊立替康對乙酰膽堿酯酶抑制作用導致的毒副作用，同時增強藥物對腫瘤的靶向性。

本文報道的ZBH－1208是我們挑選的一個代表性的化合物，實驗采用MTT法測定ZBH－1208對多種腫瘤細胞株的體外生長抑制作用，并以人結腸腺癌SW1116細胞為靶細胞，研究藥物對SW1116細胞周期和凋亡的影響，初步探討藥物作用機制，為進一步深入的體內外研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

IMDM培養(yǎng)基購自Gibco；胎牛血清購自Hyclone公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma公司；RIPA細胞裂解液、ECL化學發(fā)光試劑盒購自碧云天公司；PVDF膜購自Roche公司；Caspase－3抗體、β－actin抗體、HRP標記的山羊抗小鼠及山羊抗兔IgG購自Santa Cruz公司；PARP抗體購于Abcam公司；COULTER○RDNA PREPTMReagents Kit購自Beckman Coulter公司；FITC Active Caspase－3Apoptosis Kit為BD公司產品。

1.2 細胞株及受試藥物

人非小細胞肺癌A549細胞、人小細胞肺癌NCI－H446細胞、人宮頸癌HeLa細胞、人胃腺癌SGC－7901細胞、人乳腺癌MCF－7細胞、人結腸癌SW1116細胞、人肝癌SMMC－7721細胞及人胚腎293細胞株均由吉林省腫瘤研究所提供。細胞常規(guī)培養(yǎng)于IMDM培養(yǎng)基中，0.25%胰酶消化傳代。伊立替康（CPT－11）、SN－38、ZBH－1208由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所設計合成并提供。藥物由DMSO溶解至100mmol／L，IMDM培養(yǎng)基稀釋，于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 MTT法檢測ZBH－1208的體外抗腫瘤活性

7種腫瘤細胞株（HeLa、A549、MCF－7、SW1116、NCI－H446、SGC－7901、SMMC－7721）和人正常二倍體293細胞株常規(guī)傳代培養(yǎng)，待細胞生長至指數期時，調整細胞密度至2.5×104個／ml接種于96孔培養(yǎng)板，待細胞貼壁后加藥。實驗設空白對照組，DMSO溶劑對照組，CPT－11陽性對照組和ZBH－1208組。藥物濃度依次為0.0032μmol／L、0.016μmol／L、0.08μmol／L、0.4μmol／L、2μmol／L、10μmol／L、50μmol／L，每個濃度設6個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔加入濃度為5mg／ml的MTT 20μl，作用4h后棄去上清液，每孔加入150 μl DMSO，輕微振蕩使甲瓚充分溶解。酶標儀測定492nm波長處的各孔吸光度（OD值）。實驗重復3次，按以下公式計算ZBH－1208和CPT－11對腫瘤細胞生長抑制率，采用回歸方程計算藥物的半數抑制濃度（IC50值）。

腫瘤細胞抑制率（%）＝1－［（實驗組OD均值－空白對照組OD均值）／（細胞對照組OD均值－空白對照組OD均值）］×100%

1.4 流式細胞術檢測ZBH－1208對SW1116細胞周期的影響

取對數生長期的SW1116細胞，調整細胞密度至5.0×105個／ml，接種于6孔板。待細胞貼壁后加入ZBH－1208、CPT－11、SN－38，藥物終濃度均為25μmol／L，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，收集細胞至離心管中，用預冷PBS洗滌細胞，重懸細胞在流式上樣管中，調整細胞濃度為1.0×106個／ml。按照DNA Prep Reagents Kit說明書，每管加入100μl DNA Prep LPR，輕輕混勻，室溫避光反應1min。加入1ml DNA Prep Stain，輕輕混勻，室溫避光反應15－20min。300目尼龍網過濾細胞，上機檢測（Beckman Coulter Epics XL／MCL），Multi－Cycle軟件分析實驗結果。

1.5 流式細胞術檢測ZBH－1208對腫瘤細胞的活化Caspase－3表達的影響

收集對數生長期的SW1116細胞，調整細胞密度為5.0×105個／ml，接種于6孔板。待細胞貼壁后加入ZBH－1208、CPT－11、SN－38，終濃度均為25 μmol／L。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h、48h、72h后收獲各組細胞，預冷PBS洗滌細胞后重懸細胞在500μl BD Cytofix／Cytoperm solution中，冰上孵育20min，1000rpm離心5min，棄上清。每個樣本用100μl BD Perm／Wash buffer和5μl FITC Caspase－3抗體重懸細胞，室溫避光孵育30min。300目尼龍網過濾細胞，流式細胞儀檢測細胞活化Caspase－3表達。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS19.0軟件，student－t檢驗進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05表示實驗組與對照組相比有顯著性差異，P＞0.05表示無顯著性差異。

2 結果

2.1 ZBH－1208的體外抗腫瘤活性

實驗選擇的靶細胞來源于宮頸癌、肺癌、乳腺癌、結腸癌、胃癌和肝癌等有代表性的實體瘤并選擇一個正常二倍體293細胞作為正常細胞對照比較藥物對正常細胞的作用。MTT實驗結果表明，ZBH－1208、CPT－11作用細胞48h后，ZBH－1208和CPT－11均可顯著抑制各腫瘤細胞增殖并呈濃度和時間依賴性。ZBH－1208對HeLa、A549、MCF－7、SGC－7901、NCI－H446和SW1116細胞均顯示出了較CPT－11更強的抑制細胞增殖的能力（圖1），IC50值在0.002μmol／L－0.265μmol／L之間，CPT－11的IC50值在0.464μmol／L－52.111μmol／L之間，特別是ZBH－1208作用人結腸癌SW1116細胞后其IC50值僅為CPT－11的1／600（表1），表明ZBH－1208對腫瘤細胞的生長抑制作用高于CPT－11。值得注意的是，ZBH－1208對293細胞的殺傷作用明顯低于CPT－11，這表明設計合成的新化合物具有高效低毒的特性。

表1 ZBH－1208和CPT－11作用后腫瘤細胞IC50比較

圖1 不同濃度ZBH－1208和CPT－11對細胞生長抑制作用比較

2.2 ZBH－1208誘導細胞周期阻滯

CPT－11作為臨床一線抗腫瘤藥物通過影響細胞周期，使其不能進行正常的有絲分裂，從而抑制腫瘤細胞生長。本實驗選用終濃度為25μmol／L的ZBH－1208作用于SW1116細胞48h后，結果顯示ZBH－1208誘導SW1116細胞發(fā)生細胞周期阻滯。實驗結果提示，ZBH－1208、CPT－11和SN－38作用SW1116細胞48h后，各組細胞中G2／M期細胞的百分比顯著增加，同時G0／G1期細胞數顯著降低。SN38的作用后，G2／M期細胞數目百分比在各組中最高，CPT－11次之，S期和G2／M期細胞比例明顯升高，ZBH－1208處理后，SW1116細胞的細胞周期顯著阻滯于G2／M期，百分比到達90%以上，其作用與SN38相當，明顯優(yōu)于CPT－11（圖2）。

圖2 藥物對細胞周期分布的影響

2.3 ZBH－1208對SW1116細胞活化Caspase－3表達的影響

細胞凋亡是由半胱氨酸蛋白酶Caspase家族執(zhí)行的胞內自殺程序，Caspase－3作為Caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行者，是細胞發(fā)生凋亡機制的關鍵組成部分，在已知凋亡通路中發(fā)揮核心作用。為了研究ZBH－1208是否誘導caspase依賴的細胞凋亡，我們采用流式細胞術檢測了藥物作用后SW1116細胞活化Caspase－3的表達。終濃度為25μmol／L的ZBH－1208、CPT－11、SN－38和DMSO處理結腸癌SW1116細胞24h、48h、72h后，檢測結果顯示，ZBH－1208作用后SW1116細胞活化Caspase－3表達的百分比顯著高于對照組，24h后即可見活化Caspase－3的表達高于CPT－11，與SN－38相當，DMSO溶劑對照組與不加藥物的空白對照組相比沒有明顯差異；藥物作用48h后ZBH－1208組活化Caspase－3高于SN－38處理組，低于CPT－11組；藥物作用72h后，三組Caspase－3表達沒有顯著差異（圖3）。

3 討論

CPT－11作為臨床一線抗腫瘤藥物已得到廣泛應用，但因其長期使用會產生耐藥性及嚴重的毒副作用，在使用劑量上具有一定的限制性［10，11］。基于CPT－11或SN－38結構改造后新合成的化合物有望克服伊立替康的毒副作用。我們的前期研究設計合成了一系列CPT－11衍生物并初步評價了其藥物特性。本研究選擇其中一個新化合物ZBH－1208，體外實驗研究藥物抗腫瘤作用的機制，獲得的結果表明，ZBH－1208可能作為一種新的癌癥化學治療劑繼續(xù)深入開發(fā)應用。

經過體外初步研究，ZBH－1208表現出顯著的生物活性，對腫瘤細胞尤其是胃腸道腫瘤細胞的生長表現出良好的抑制作用，明顯強于母體化合物CPT－11，IC50值顯著低于CPT－11（P＜0.05），提示我們與ZBH－1208類似的一系列合成的新化合物具有超過CPT－11的作用。實驗選取了七種腫瘤細胞株對ZBH－1208的體外抗腫瘤活性進行了初步評價，結果顯示，ZBH－1208水溶性高，對乙酰膽堿酯酶的抑制作用低，可以克服CPT－11的毒副作用，體外抗瘤具有廣譜性，對各株腫瘤細胞有較好的生長抑制作用，抗其抗腫瘤活性高于CPT－11和SN－38，藥物在較低濃度時即可顯著誘導腫瘤細胞凋亡，作用機制有別于CPT－11和SN－38，可能更多涉及凋亡信號通路的改變，更深入的藥物作用機制有待進一步研究。

在真核生物中，細胞周期調控是細胞生長過程中的主要調節(jié)機制，G2／M期是細胞進行分裂之前在細胞周期中表現高度復雜的關鍵階段，細胞周期阻滯在G2／M期，是各種DNA損傷劑表現出的共同細胞反應［12］。通過PI染色使用流式細胞術我們觀察到新型化合物ZBH－1208引起細胞周期阻滯于G2／M期，提示ZBH－1208與母藥CPT－11相似，是作為一種DNA損傷劑殺傷腫瘤細胞。同時ZBH－1208的抗腫瘤作用高于SN38。

圖3 藥物對活化Caspase－3蛋白表達的影響

除了控制細胞周期的調節(jié)，細胞生長過程中，細胞增殖與細胞凋亡之間保持著一種動態(tài)平衡是維持自身穩(wěn)定的重要因素［13］，細胞凋亡即細胞程序性死亡，是細胞分化成熟過程中普遍存在的途徑，是半胱氨酸蛋白酶Caspase家族活化，開啟胞內自殺的程序［14，15］，一些治療和化學預防劑可通過誘導細胞凋亡消除癌細胞。我們通過前期實驗推測ZBH－1208殺傷腫瘤細胞，抑制腫瘤細胞生長可能通過誘導細胞凋亡實現。caspase－3在DNA損傷、修復、和誘導凋亡過程中扮演著重要的角色［16］，本研究中我們應用流式細胞術驗證了活化形式caspase－3的表達隨藥物濃度增高而上調，表明ZBH－1208可以增加腫瘤細胞活化caspase－3的表達水平，提示ZBH－1208可誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡且誘導凋亡是通過caspase途徑實現的。我們在后續(xù)的試驗中將會進一步深入分析，探究藥物作用的確切機制。

綜上所述，新型化合物ZBH－1208可以通過誘導細胞周期阻滯、腫瘤細胞發(fā)生凋亡來抑制其生長增殖。本研究對ZBH－1208的抗腫瘤作用進行了體外評價，對其抗腫瘤作用機制進行了初步研究，為CPT－11類似物的構效關系研究增添了新的內容，為同類化合物的結構修飾、改造和開發(fā)提供了研究思路、實驗數據和理論參考。研究結果表明合成的新化合物具有進一步開發(fā)研究的價值。

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Study on anti－tumor activity and mechanism of novel Irinotecan derivatives ZBH－1208 in vitro

ZHAO Jing1＊，YU

Hong2＊，WU Di3，et al.（1.Key laboratory for Zoonosis Research，Ministry of Education，Institute of Zoonosis，Jilin University，Changchun 130062，China；2.Cell Biology Laboratory，Jilin Province Tumor Institute，Changchun 130012，China；3.Tumor Center of First Clinical Hospital，Jilin University，Chanchun130021，China）

ObjectiveTo investigate the inhibition effect on the growth of tumor cells of novel Irinotecan derivatives ZBH－1208in vitro and further probe its anticancer mechanisms.MethodsMTT assay was used to evaluate the preliminary anti－tumor effect of ZBH－1208on A549，NCI－H446，HeLa，SGC－7901，MCF－7，SW1116，SMMC－7721and 293cell lines.Cytotoxicity for the tumor cells was assessed by the tumor cell growth inhibition rates and IC50.Flow cytometry analysis was performed to analyze the expression of Caspase－3and cycle distribution of the tumor cells treated with ZBH－1208.ResultsZBH－1208had significant anti－proliferation effects on A549，NCI－H446，HeLa，SGC－7901，MCF－7，SW1116，SMMC－7721cell lines，and was dependence on concentration and time variant.IC50of seven cancer cell treated with ZBH－1208were significantly lower than that of CPT－11（P＜0.05）.Cell cycle of the tumor cells treated with ZBH－1208were arrested in G2／M phase.The expression of active Caspase－3in the tumor cell was generally up－regulated.ConclusionComparison with CPT－11and／or SN38，the novel compound ZBH－1208was more efficient and lowertoxicity in significant inhibit growth of the tumor cells.ZBH－1208play an important role in the apoptosis inducement of tumor cells by arresting the tumor cells cycle and would positive contribute to on further research in clinical treatment.

Irinotecan；Derivatives；Cell cycle arrest；Cell apoptosis

R965.3

A

趙靜（1989－），女，內蒙古包頭人，碩士研究生，研究方向：獸醫(yī)公共衛(wèi)生學研究。

2014－10－25）

1007－4287（2015）02－0181－06

吉林省科技發(fā)展計劃應用基礎研究項目（20130102097JC）；吉林省衛(wèi)生廳研究項目（2012Z037）

＊通訊作者