cks1siRNA對舌癌的細胞凋亡的影響研究

徐亞娟，高元奇，付丹陽，祁 婧，楊秋野，劉文書

（1.吉林省腫瘤醫院，吉林長春130012；2.吉林大學基礎醫學院；3.吉林大學臨床醫學院；4.吉林大學第一醫院）

cks1siRNA對舌癌的細胞凋亡的影響研究

徐亞娟1，高元奇2，付丹陽3，祁 婧3，楊秋野3，劉文書4＊

（1.吉林省腫瘤醫院，吉林長春130012；2.吉林大學基礎醫學院；3.吉林大學臨床醫學院；4.吉林大學第一醫院）

近年來研究表明，腫瘤的發生、發展是細胞周期調控因子的異常而導致細胞周期紊亂所致，因此，尋找有關的調控因子與腫瘤的發生、發展的關系進行研究，對腫瘤的治療具有重要的意義［1］。Cks1是細胞周期蛋白依賴性激酶的亞基，它是高度保守的Sucl／cks家族成員，能與其他細胞周期蛋白激酶和磷酸化蛋白結合，參與細胞周期的調控，與腫瘤的發生、發展密切相關［2］。本文用RNA干擾抑制CKS1的表達，觀察其對舌癌細胞的細胞周期和凋亡的影響，為其基因治療舌癌提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

人舌癌細胞Tca8113購自北京博楓科生物科技有限公司；培養基采用DMEM（美國，Gibco公司）；10%胎牛血清（以色列）和雙抗，合成Cks1siRNA：5’－UGGAGGAAUCUUGGCGUUCUUTT－3’（有意義鏈），5’－UUCUUCGAACGUGUCACGUTT－3（無關對照鏈）（上海GenePharma公司）。siRNA序列進行2＇Ome修飾（穩定化學結構）和5＇FAM修飾（綠色熒光）。GenePharma siRNAMateTM轉染試劑盒。RAPI裂解液（上海碧云天生物技術有限公司）；BCA試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；內參抗體GAPDH抗體購自美國Abcame公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人舌癌細胞Tca8113采用含10%胎牛血清的DMEM培養基在5%CO2、37℃細胞培養箱中培養。細胞生長至90%匯合，0.25%胰酶（含1%EDTA）消化，含血清DMEM終止消化，吹打細胞成單細胞懸液，1∶4比例傳代。倒置顯微鏡下觀察細胞形態。取對數生長期的細胞用于以下試驗。

1.2.2 Cks1siRNA轉染 合成Cks1siRNA：5’－UGGAGGAAUCUUGGCGUUCUUTT－3’（有意義鏈），5’－UUCUUCGAACGUGUCACGUTT－3（無關對照鏈）siRNA序列進行2＇Ome修飾（穩定化學結構）和5＇FAM修飾（綠色熒光）。按GenePharma siRNA－MateTM轉染試劑盒和siRNA－MateTM轉染試劑盒操作。體外培養細胞至2.5×104個／mL，并提前一天將細胞接種在24孔板中，待細胞的匯合度在30%－50%采用siRNA－MateTM轉染試劑盒將CKS1siRNA導入Tca8113細胞，37℃，CO2培養箱孵育。

1.2.3 western blot檢測轉染前后Tca8113細胞的Cks1蛋白表達水平 收集細胞，將細胞分為3組，每組分別為空白組、陰性對照組、siRNATca8113組，每組設3個復孔?？瞻捉M的Tca8113細胞用0.25%胰蛋白酶消化Tca8113細胞，制成單個細胞懸液，以每孔5×103個接種于96孔培養板，補足高糖DMEM培養液至100μl，在CO2孵育箱中37℃、5%CO2以及飽和濕度的條件下，培養24 h；陰性組（與人類基因組序列無同源性）和siRNA組Tca8113細胞先進行CKS1siRNA轉染4h，CKS1－siRNA轉染濃度為10UM。通過SDSPAGE和western blot對轉染前后Tca8113細胞的Cks1蛋白表達水平進行檢測。

1.2.4 轉染前后Tca8113細胞周期及細胞凋亡的檢測 細胞的培養如上準備，按操作說明書進行Annexin V－FITC和碘化丙啶染色后，采用流式細胞儀對轉染前后Tca8113細胞的凋亡率及細胞周期的影響進行檢測。檢測細胞周期百分數、凋亡指數、增殖指數作為評估參數，每組細胞獲得10個數值。

1.2.5 統計學方法 所有數據通過Excel電子表格輸入計算機建立數據庫進行整理，計算出各組各參數的均值及標準差（x—±s），作為主要描述性指標；方差分析各主要指標的差異進行比較。全部統計計算應用SAS軟件包完成。

2 結果

2.1 Western blot檢測siRNA轉染后Tca8113細胞Cks1蛋白表達水平的影響

經Imagej軟件分析圖像灰度值，進行半定量分析，各組之間的比值差異2倍以上認定為有顯著性差異。如圖1、表1所示，siRNA轉染后的Cks1蛋白水平顯著下降，與對照和空白siRNA組比較均有顯著性差異。

圖1 Western blot檢測siRNA對Tca8113細胞Cks1蛋白水平的影響

表1 CKS1的蛋白表達水平

2.2 siRNA轉染對細胞凋亡的影響結果

見表2。與空白對照比較，陰性轉染對照組無明顯變化，轉染組的凋亡細胞比例顯著高于對照（P＜0.05）。

表2 流式檢測siRNA轉染前后Tca8113細胞的凋亡率的比較（%）

2.3 siRNA轉染對細胞周期的影響結果

見表3。與空白對照比較，陰性轉染對照組無明顯變化，轉染組G2期細胞比例顯著增多（P＜0.05）。細胞周期阻滯于G2期。

表3 轉染處理前后Tca8113細胞的細胞周期的比較（%）

3 討論

Cks1是高度保守的細胞周期調節蛋白Suc1／Cks蛋白家族成員之一。目前已經有大量的研究表明Cks1在多種腫瘤的病理組織中（包括胃癌、乳腺癌和直腸癌等）高表達，并發揮著一定的生物學功能［3－5］。

Cks1siRNA在抑制多種腫瘤的表達中可能發揮重要作用。Wang等［6］運用RNA干擾技術證實了干擾Cks1基因能促進乳腺癌細胞凋亡。Tsai等［7］利用RNA小分子干擾實驗對肺癌和上皮癌進行實驗研究發現，腫瘤細胞停滯在G2／M期，并且腫瘤細胞出現了大量的凋亡。但對正常的細胞無明顯的生長抑制和凋亡的作用，提出Cks1干擾可作為癌癥基因治療的靶點。本實驗結果顯示Cks1siRNA成功地干擾了Tca8113細胞中的cks1蛋白的表達。轉染組的凋亡細胞比例顯著高于空白組和陰性轉染組對照組（P＜0.05），增加了細胞出現了凋亡。轉染組G2期細胞比例顯著增多，顯示了轉染Cks1siRNA引起細胞的G2／M阻滯，細胞能夠復制DNA，但是不能完成有絲分裂，使得細胞無法完成復制，與凋亡檢測結果吻合。與文獻的報道相一致。Cks1siRNA抑制了Tca8113細胞阻滯于G2期，增加了細胞出現凋亡，研究結果為Cks1siRNA治療舌癌的進一步的實驗研究提供實驗基礎。

［1］Kratzat S，Nikolova V，Miething C，et al.Cks1is required for tumor cell proliferation but not sufficient to induce hematopoietic malig－nancies［J］.PLoS One，2012，7（5）：e37433.

［2］張秀梅，金 松，劉 曙，等.Cks1在老年肝細胞癌中的表達及臨床意義［J］.中國腫瘤外科雜志，2013，5（4）：239.

［3］Masuda TA，Inoue H，Nishida K，et al.Cyclin－dependent kinase 1 gene expression is associated with poor prognosis in gastric carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2003，9（15）：5693.

［4］Westbrook L，Manuvakhova M，Francis GK，et al.Cks1regulates cdk1rxpression：a novel role during mitotic en－try in breast cancer cells［J］.Cancer Res，2007，67（23）：11393.

［5］Shapira M，Ben－Izhak S，et al.The prognostic im－pact of the ubiquitin ligase subunits Skp2and Cks1in colorectal carcinoma［J］.Cancer，2005，103（7）：1336.

［6］Wang XC，Tian J，Tian L，et al.Role of Cks1amplification and overexpression in breast cancer［J］.Biochem Biophys Res Commun，2009，379：1107.

［7］Tsai YS，Chang HC，Chuang LY，et al.RNA Silencing of Cks1Induced G2／Mm Arrest and Apoptosis in Human Lung Cancer Cells［J］.IUBMB Lufe，2005，57：583.

2014－08－12）

1007－4287（2015）02－0202－02

吉林省發展和改革委員會資助（項目編號：JF2012C006－8）

＊通訊作者