燈盞花乙素苷元的微生物限度檢查方法驗證

趙加強周榮光，*楊兆祥王 金袁正東

1.昆明制藥集團股份有限公司，云南 昆明 650100；2.昆明醫科大學，云南 昆明 650500；3.昆明理工大學生命科學與技術學院，云南 昆明 650224

燈盞花乙素苷元的微生物限度檢查方法驗證

趙加強1周榮光1，2*楊兆祥1王 金3袁正東2

1.昆明制藥集團股份有限公司，云南 昆明 650100；2.昆明醫科大學，云南 昆明 650500；3.昆明理工大學生命科學與技術學院，云南 昆明 650224

目的：建立燈盞花乙素苷元的微生物限度檢查方法。方法：按照 《中國藥典》2010版要求，采用常規法對代表性的細菌、霉菌、酵母菌進行回收率測定，并對控制菌檢查法進行方法學驗證。結果：采用常規法，5種試驗菌的回收率均大于70%。結論：可采用常規法對燈盞花乙素苷元進行微生物限度檢查。

燈盞花乙素苷元；微生物限度檢查；方法學驗證

燈盞花乙素苷元又名野黃芩素，是燈盞花乙素在人體內的代謝產物，具有抗血栓、抑制血小板聚集、增加腦血管血流量等藥理活性，其生物活性是燈盞花乙素的5倍以上［1］。燈盞花乙素苷元天然存在于燈盞花等植物中，但含量極低，不到萬分之一。我們以燈盞花素 （主要成分為燈盞花乙素）為原料，采用人工半合成方法實現了燈盞花乙素苷元的批量生產［2］。本文旨在按照中國藥典的要求［3］，建立燈盞花乙素苷元的微生物限度檢查方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器 HTY－2000A集菌儀（杭州高得醫療器械有限公司）；開放式集菌器 （北京牛?；蚣夹g有限公司）；303－6B隔水式恒溫培養箱 （南通科學儀器廠）；霉菌培養箱（上海躍進醫療器械有限公）。

1.2 供試樣品 燈盞花乙素苷元（批號：201208025、20120826、20120827，昆明制藥集團股份有限公司藥物研究院）。

1.3 培養基 改良馬丁液體培養基（批號：120327）、改良馬丁瓊脂培養基（批號：120319）、玫瑰紅鈉瓊脂培養基（批號：120207）、營養肉湯培養基（批號：120122）、營養瓊脂培養基（批號：111225）、膽鹽乳糖培養基（批號：120415）、4－甲基傘形酮葡糖苷酸（MUG）培養基（批號120622）均由北京三藥科技開發公司提供。

1.4 菌種 枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis［CMCC（B）63501］、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus［CMCC（B） 26003］、大腸埃希菌Escherichia coli［CMCC（F）44102］、白色念珠菌Candida albicans［CMCC（F）98001］、黑曲霉Aspergillus niger［CMCC（F）98003］均由中國藥品生物制品檢定所提供。

2 實驗方法

2.1 菌液制備 分別接種枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中，于32～35℃培養24 h，用0.9%的無菌氯化鈉溶液以10倍稀釋法稀釋至10－5～10－7，制成每1ml含菌數為50～100 cfu的菌懸液備用。

接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中，于24～26℃培養48 h，用0.9%的無菌氯化鈉溶液以10倍稀釋法稀釋至10－4～10－6，制成每1 ml含菌數為50～100 cfu的菌懸液備用。

取黑曲霉菌的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基中，于24～26℃培養7 d，用5ml 0.9%的無菌氯化鈉溶液將孢子洗脫，取洗脫液以10倍稀釋法稀釋至10－4～10－6，制成每1ml含菌數為50～100cfu的菌懸液備用。

2.2 供試液制備 取供試樣品10g于滅菌容器中，加入pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液100 m l，混勻，得1∶10的供試液備用。

2.3 菌落計數方法及驗證

2.3.1 菌落計數方法 采用常規法對細菌、霉菌及酵母菌進行菌落計數，通過回收率測定進行方法學驗證［3］。

2.3.2 回收率測定 試驗組：取1∶10供試液1ml、含50～100cfu試驗菌的菌液1ml加入平皿中，5種試驗菌每種菌平行制備2個平皿。在加有枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌菌液的平皿中，立即傾注營養瓊脂培養基，待凝固后，于32～35℃培養48 h，觀察記錄菌落數；在加有黑曲霉菌、白色念珠菌菌液的平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，待凝固后，于24～26℃培養72 h，觀察記錄菌落數。

菌液組：取含50～100cfu試驗菌的菌液1ml加入平皿中，5種試驗菌每種菌平行制備2個平皿。在加有枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌菌液的平皿中，立即傾注營養瓊脂培養基，待凝固后，于32～35℃培養48 h，觀察記錄菌落數；在加有黑曲霉菌、白色念珠菌菌液的平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，待凝固后，于24～26℃培養72 h，觀察記錄菌落數。

供試品對照組：取1∶10供試液1ml加入平皿中，共制備10個平皿。在5個平皿中，立即傾注營養瓊脂培養基，待凝固后，于32～35℃培養48 h，觀察記錄菌落數；在另外5個平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，待凝固后，于24～26℃培養72 h，觀察記錄菌落數。

回收率計算方法：試驗組的菌回收率 （%）＝（試驗組菌落數平均值－供試品對照組菌落數平均值）／菌液組菌落數平均值×100%。

2.4 控制菌 （大腸埃希菌）檢查方法及驗證

2.4.1 控制菌檢查方法 采用常規法對控制菌大腸埃希菌進行檢查。

2.4.2 控制菌檢查方法的驗證 試驗組：取1∶10供試液10m l，含50～100 cfu大腸埃希菌的菌液1ml，加入100m l膽鹽乳糖培養基中，于32～35℃培養24h。

陽性對照組：取含50～100cfu大腸埃希菌的菌液1ml，加入100m l膽鹽乳糖培養基中，于32～35℃培養24h。

陰性菌對照組：取1∶10供試液10ml，含50～100 cfu金黃色葡萄球菌的菌液1ml，加入100ml膽鹽乳糖培養基中，于32～35℃培養24h。

供試品對照組：取1∶10供試液10ml，加入100ml膽鹽乳糖培養基中，于32～35℃培養24h。

檢查方法：分別取上述試驗組、陽性對照組、陰性菌對照組和供試品對照組的培養物0.2 ml接種至裝有5m l MUG培養基的試管內，32～35℃培養24h，在366nm紫外線下觀察，若管內培養物出現熒光，為MUG熒光陽性；否則，為MUG熒光陰性。觀察后滴加靛基質試液，若液面呈玫瑰紅色，為靛基質陽性；若液面顏色無變化，為靛基質陰性。

表2 控制菌檢查方法的驗證

3 結果

由表1可見，采用常規法驗證，枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉菌回收率均大于70%，說明燈盞花乙素苷元對上述5種菌株無明顯抑制作用。由表2可知，燈盞花乙素苷元的控制菌檢查可按常規法進行。

4 討論

燈盞花乙素苷元為人工半合成，不同生產工藝下得到的燈盞花乙素苷元產品，其所含雜質或溶劑殘留成分往往不盡相同，其抑菌行為或抑菌作用的強弱程度也往往不同。因此，當燈盞花乙素苷元生產工藝或方法發生變動時，應對產品的微生物限度檢查方法進行重新驗證。微生物限度檢查是藥品質量檢查的重要內容。在人工合成藥物的研制過程中，一些研究機構或研究人員往往只注重產品本身的化學成分質量研究，而忽視或根本不進行產品的微生物限度檢查或方法學研究，這是不科學、不合理的。按照 《中國藥典》的要求，應對用于非規定滅菌制劑的合成原料藥進行微生物限度檢查及方法學驗證，檢查項目包括細菌數、霉菌數、酵母菌數及控制菌檢查。

燈盞花乙素苷元對枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉菌5種菌株無明顯抑制作用，可采用常規法對其進行微生物限度檢查。

［1］車慶明，潘麗怡，陳穎，等.燈盞花乙素苷元的藥動學研究 ［J］.中國藥學雜志，2007，42（18）：1418－1421.

［2］周榮光，晏澤宇，趙加強，等.野黃芩素的制備、純化與結構表征［J］.光譜實驗室，2011，28（5）：2403－2406.

［3］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典 （二部）［S］.北京：中國醫藥科技出版社，2010，附錄：108－110.

Validation of M icrobial Lim it Tests of Scutellarein

ZHAO Jia-qiang1ZHOU Rong-guang1，2*YANG Zhao-xiang1WANG Jin3YUAN Zheng-dong2
1.Institute for Drug Research and Development of Kunming Pharmaceutical Corporation，Kunming 650100，China；2.School of Pharmaceutial Science，Kunming Medical University，Kunming 650500，China；3.State Key Laboratory of Phytochemistry and Plant Resources in West China，Kunming Institute of Botany，Chinese Academy of Sciences，Kunming 650204，China

Objective To establish amicrobial limits testingmethods for Scutellarein.M ethods The Validation of countingmethod of bacteria，mold and yeast，and the validation of control bacteria check method was done in accordance with the ordinarymethod in the chinese pharmacopoeia（2010 edition）.Results With ordinarymethod，recovery rates of5 testmicroorganismswere allmore than 70%.Conclusion The ordinarymethod could be used for Microbial Limit Tests of Scutellarein.

Scutellarein；Microbial limit test；Methodology Validatio

R927.11

A

1007－8517（2015）01－0032－02

2014.10.11）

昆明市科技計劃項目（20120401AS021029），云南省科技計劃項目（2013FZ260）。

趙加強 （1971－），男，工程師，主要從事藥物質量研究。

周榮光（1969－），男，碩士生導師。E－mail：rgzhousy＠163.com