SAT技術檢測肺結核患者痰標本中結核分枝桿菌的臨床應用研究

張慧慧，熊國亮

(江西省胸科醫院，江西 南昌330006)

結核病是嚴重危害人民健康的呼吸道傳染病。中國是全球結核病高發的國家之一。根據2010年全國第5次結核病流行病學調查結果，我國全人群活動性肺結核患病率為459/10萬，其中傳染性肺結核患病率為66/10萬[1]。實現對結核病患者早期治療的基礎是早期快速診斷，這也是預防和控制結核病傳播的重要手段。結核分枝桿菌檢測是結核病診斷的重要依據之一，目前臨床上常用方法有：直接涂片抗酸染色法，該方法操作簡便、快速，但其敏感度低，特異度也較差，不能區分結核和非結核分枝桿菌，不能辨別是否活菌；羅氏培養是結核病診斷的金標準，但羅氏培養和菌種鑒定需要6~8周，不能達到結核病早期診斷的要求[2-4]。傳統的分子生物學方法為擴增結核分桿菌特異性的DNA片段并進行探針雜交或進行熒光定量檢測[5-8]。本研究采用RNA恒溫擴增實時檢測(simultaneous amplification and testing,SAT)新技術檢測肺結核患者痰標本中的結核分枝桿菌，并探討該枝術對肺結核的臨床診斷價值。

1 對象與方法

1.1 對象 2014年6月至10月我院結核科住院137例肺結核患者，其中男94例，女43例；年齡18~76歲，平均(46±13)歲；結核病的診斷標準參照文獻[9]；收集所有患者的晨痰標本137例(留取痰標本時護士應對患者進行指導)。2014年7月我院腫瘤科和呼吸科住院的其他肺部疾病患者41例為對照組，其中男30例，女11例；年齡34~73歲，平均(48±15)歲；15例為肺部腫瘤患者，26例為其他細菌引發的呼吸系統炎癥(肺炎12例、支擴8例、COPD6例)患者；收集所有患者的晨痰標本41份。本研究經我院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 DA7600擴增儀由中山達安公司提供；分枝桿菌細胞破碎儀，SAT試劑盒 (批號為：20140201)由上海仁度生物科技有限公司提供；改良羅氏培養基由我院檢驗科自配。

1.2.2 痰標本處理 2倍體積4%NaOH加入痰液中，使痰液充分勻化，室溫放置20min左右。吸取1ml痰混懸液移入1.5ml離心管內，13000r/min離心5 min，棄上清，加入1ml生理鹽水重懸洗滌，13000r/min離心 5min，棄上清，加入50μlTB稀釋液重懸。將重懸液放入分枝桿菌細胞破碎儀中進行超聲處理15min,超聲功率為300W。

1.2.3 SAT-TB擴增檢測 取2μl處理物加入30μl擴增檢測液中，將反應管置于干熱恒溫器上60℃保溫10min后，再置于42℃保溫5min，同時將酶液預熱至42℃。預熱后，向每支反應管中加入10μl酶液(含M-MLV逆轉錄酶和T7RNA轉錄酶)，混勻后將反應管快速轉至DA7600型實時熒光定量擴增儀中啟動反應程序。反應程序為熒光通道設定為FAM，每個循環為42℃、1min，共40個循環；熒光信號收集1次/min，共檢測40次。樣本曲線與閾值線交叉點的橫坐標讀數(檢測時間)＜40min的樣本為陽性樣本。引物序列為 5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAATAGGCCGT

CACCCCACCAACAAGCTG-3’ 和 5’ -CCACCCACGGGAUGCAUGCUGG-3’， 探 針 序 列 5’-CCAGCCACGGGAUGCAUGGUGG-3’。 SAT-TB 檢測全程操作及檢測時間約2h。

1.3 同份痰標本同時做涂片抗酸染色和羅氏培養及菌種鑒定 涂片抗酸染色和羅氏培養操作方法參見《結核病診斷實驗室檢驗規程》[10]。分枝桿菌菌種鑒定采用的是分離鑒定培養法：利用結核分枝桿菌復合群和非結核分枝桿菌對PNB(對硝基苯甲酸)、TCH(噻吩-2-羧酸)二種藥物的耐受性不同，將臨床分離菌株制成菌懸液，接種于含該二種藥物的培養基上，觀察分枝桿菌在培養基上的生長情況，可鑒別結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌。

1.4 統計學方法 計算SAT檢測痰樣本的靈敏度及特異度。統計學分析采用SPSS13.0軟件，采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SAT-TB檢測結果與痰涂片和羅氏培養結果的對比 在137例肺結核患者痰標本中SAT-TB檢測陽性率55.5%(76/137)，高于涂片抗酸染色陽性率24.8%(34/137)差異有統計學意義 (χ2=26.79,P<0.005)；高于羅氏培養陽性率47.4%(65/137)，但差異沒有統計學意義(χ2=1.77，P>0.05)。

2.2 菌種鑒定結核分枝桿菌62例，非結核分枝桿菌3例。

2.3 41例非結核患者痰標本 涂片抗酸染色、羅氏培養、SAT-TB檢測均為陰性結果。見表1。

表1 涂片抗酸染色、羅氏培養、SAT-TB檢測結果

2.4 SAT-TB檢測不同肺結核病患者中的檢測結果 見表2。

表2 不同類型肺結核病患者SAT-TB檢測陽性率

3 討論

SAT-TB檢測技術原理是以結核分枝桿菌特異的16srRNA為檢測靶標，通過恒溫RNA擴增技術擴增靶標片段，熒光標記的探針與靶標片段的擴增產物雜交后釋放出熒光信號，對熒光信號進行實時檢測，從而快速準確地判斷待檢樣本中是否有結核分桿菌存在。與傳統的基于DNA為模板的核酸擴增技術相比，該技術只檢測活的結核分枝桿菌，因為結核分枝桿菌死亡后RNA便降解，但DNA存在于活和死亡的結核分枝桿菌中，因此SAT-TB技術的檢測可作為結核病是否活動性及用藥之后療效的監測[11,12]。

本研究中，SAT-TB檢測技術對肺結核診斷的敏感性為55.5%，特異性為100.0%。其敏感性與倪麗麗等報道相近56.5%[13]，但低于沙巍等報道的58.3%[14]。在3例非結核分枝桿菌病中(在病例初入選時全部列為肺結核病患者)涂片抗酸染色和羅氏培養都為陽性，但SAT-TB檢測結果均為陰性，因此該方法在快速鑒別非結核分枝桿菌和結核分枝桿菌時具有一定的輔助診斷作用。本研究還發現，SAT-TB檢測痰培養陽性患者的陽性率為95.4%高于痰涂片抗酸染色陽性患者的陽性率88.2%；有1例患者痰涂片抗酸染色為陽性，但羅氏培養和SAT-TB檢測均為陰性結果，說明SAT-TB技術只檢測活的結核分枝桿菌[15]。

綜上所述，SAT-TB檢測痰標本中結核分枝桿菌的檢測時間短，敏感度好，特異度高，該方法是一種較有前景的實驗室診斷方法。

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