232例終末期腎功能衰竭患者HLA基因多態性分析

熊莉，孫瑜，肖莉，吳紅，李國良

(江西省血液中心，江西 南昌330052)

終末期腎功能衰竭(ESRD)是各類原發的或繼發的腎臟疾病發展到晚期的共同結果。有研究報道[1]HLA在ESRD的發生、發展中發揮重要作用。國外一些腎移植中心通過對ESRD患者HLA多態性的分析研究，認為HLA的表達及其多態性對腎臟疾病患者最終并發ESRD存在免疫遺傳易感性和相對風險性。本研究對等待腎移植的232例江西籍漢族ESRD患者及2210例中國造血干細胞庫江西籍漢族志愿捐獻者的HLA基因分型進行比較，分析探討終末期腎功能衰竭與HLA基因的關聯性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 病例組：2012-2013年在我中心做器官配型的江西籍終末期腎功能衰竭患者232例，均為漢族。男118例，女115例，年齡18~62歲，對照組：程良紅等[2]研究的江西籍漢族骨髓供者2210例，性別、年齡與病例組相當。

1.2 基因組DNA提取 取乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血，用Texas基因組DNA抽提試劑盒分離獲得，-20℃保存待用。。

1.3 HLA基因分型 運用序列特異性引物聚合酶鏈法，采用美國Texas Biogene公司試劑盒進行檢測，具體操作按照說明書。擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像儀觀察結果。

1.4 統計學方法 利用SPSS 19.0軟件計算基因頻率及其風險關聯系數(RR)、χ2和P值。若RR＞1，則認為該位點是疾病發生的危險因素；若RR＜1，則認為該位點在疾病發生過程中起保護作用。若RR=1，則表示該位點與疾病發生無相關性。HLA基因頻率(GF)采用直接計數法，選擇HLA抗原特異性作為計數標準。

2 結果

2.1 HLA-A位點基因頻率 病例組HLA-A等位基因中，前 3 位依次是 A*11、A*02、A*24，對照組HLA-A等位基因中，前3位依次是A*02、A*11、A*24。HLA-A*11的基因頻率病例組顯著高于對照組(P<0.05)；HLA-A*31、A*33的基因頻率病例組顯著低于對照組(P<0.05)，其他組別差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 病例組與對照組HLA-A基因位點分析

2.2 HLA-B位點基因頻率 病例組HLA-B等位基因中，前 3 位依次是 B*40、B*15、B*46，對照組HLA-B等位基因中，前3位依次是B*40、B*46、B*15。HLA-B*53、B*55的基因頻率病例組顯著高于對照組 (P<0.05)；HLA-B*58的基因頻率病例組顯著低于對照組(P<0.05)，其他組別差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 病例組與對照組HLA-B基因位點分析

2.3HLA-DRB1位點基因頻率 病例組HLADRB1等位基因中，前 4位依次是DRB1*04、DRB1*09、DRB1*12、DRB1*15， 對 照 組 HLADRB1等位基因中，前 4位依次是DRB1*09、DRB1*12、DRB1*15、DRB1*04。HLA-DRB1*04 的基因頻率病例組顯著高于對照組(P<0.05)，其他組別差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

2.4 HLA基因與ESRD的發生風險 病例組較對照組HLA基因頻率顯著升高的有A*11、B*53、B*55、DRB1*04，相對危險率均大于 1(RR>1)；病例組較對照組HLA基因頻率顯著降低的有A*31、A*33、B*58，相對危險率均小于1(RR<1)。根據MH卡方檢驗，只有HLA-B*53在病例組與對照組中有統計學意義(P<0.05),提示HLA-B*53可能是終末期腎功能衰竭的易感基因。見表4。

表3 病例組與對照組HLA-DRB1基因位點分析

表4 HLA基因與ESRD的發生風險分析

3 討論

HLA是控制機體免疫應答和免疫調節的重要系統，是人類發現的第一個與疾病有明確關聯的遺傳系統[3]。腎臟疾病患者并發終末期腎功能衰竭的發病機制尚未明了，一般認為多數是由免疫介導的炎癥反應所致。據1998年統計，HLA與腎臟疾病的關聯主要涉及7種疾病，相關聯的HLA抗原達18種，它們在腎臟疾病的發生、發展及預后中起重要作用[4]。

有關HLA等位基因與腎臟疾病相關性的研究國內外已有報道，但由于地域、人種、樣本大小及研究方法的不同，各家報道結果也不同。KARAHAN等[5]報道土耳其587例不同原發病最終并發終末期腎功能衰竭患者高表達HLA-B*58和HLA-DRB1*03，并認為易感基因的確定可能對延緩腎臟疾病向終末期腎病進展和預防移植后原發病再發的研究有重要意義。CRISPIM等[6]報道105例巴西籍等候腎移植的終末期腎功能衰竭患者HLA-A*78、HLA-DRB1*11抗原頻率顯著增加，HLA-B*14顯著減少，提示HLA-A*78、DRB1*11可能是巴西籍腎臟疾病患者并發ESRD的易感基因。PEYMAN PD[7]等報道阿塞拜疆尿毒癥患者HLA-A*1l、HLA-A*33和 HLA-B*49抗原頻率與健康對照組相比顯著升高，并指出攜帶易感基因的阿塞拜疆終末期腎病患者預后較差。劉偉等[8]研究發現 HLA-A*03、A*23、A*26、B*08、B*50、DRB1*04、DRB1*10對終末期腎功能衰竭患者有遺傳易感性，HLA-A*01、A*11、B*13、B*46、DRB1*15、DQB1*09 則是這類患者的保護基因。HLA基因的地域差異性不僅表現在ESRD患者當中，其他疾病也有類似報道[9]。

本研究對232例江西籍漢族終末期腎功能衰竭患者以及2210例健康無血緣關系的江西籍漢族造血干細胞志愿捐獻者進行HLA-A/B/DRBl基因分型，結果提示：病例組HLA-A*11、B*53、B*55、DRB1*04基因頻率明顯高于對照組，病例組HLA-A*31、A*33、B*58基因頻率明顯低于對照組(P<0.05)。本研究的結論與以往存在差異，這表明HLA與ESRD的關聯性存在人群和地域特異性，因此，對不同地域的人群應作具體分析，不能將一個人群的研究結果直接應用于其他人群。

病例組中基因頻率較高的分別為HLAA*11、A*02、A*24； B*40、B*15、B*46；DRB1*04、DRB1*09、DRB1*12、DRB1*15；其基因頻率均大于10%。與本地區健康人群基因頻率基本一致，因此，具有此類基因的患者在本地區找到合適的供體機會較大。

在研究HLA與疾病關系的文獻中，部分作者僅根據病例組和對照組的HLA基因頻率分布差異，計算出χ2值有統計學意義，就得出“易感基因”或“保護基因”的結論。筆者認為這種推斷有失嚴謹，因為該χ2值的大小取決于HLA基因頻率的大小和樣本數量，它不能作為關聯強度的量度。因此我們還需引進相對危險率 (RR)，即表示攜帶某HLA基因的個體發生ESRD的危險性是不攜帶該基因個體發生ESRD危險性的多少倍。只有RR的顯著性檢驗有統計學意義，才可能推論該基因位點是否與疾病有關聯性。本研究資料中，雖然根據χ2值 ，HLA-A*11、A*31、A*33、B*53、B*55、B*58和DRB1*04在病例組和對照組中的差異均有統計學意義，但是根據MH卡方檢驗，只能提示HLAB*53才可能是ESRD的易感基因。

由于病例組抽樣人數有限，因此與對照組比較，病例組檢出的等位基因數量偏少；另外，這種規模的樣本計算低頻基因往往誤差較大；而且頻率越小，誤差越大，劉楠等[10]發現頻率小于5%的等位基因，誤差往往會超過頻率的20%。HLA-B*53基因頻率為0.43%，屬于低頻基因。筆者認為不可簡單的將其定義為“易感基因”。綜合統計分析的結果，我們最終認為終末期腎功能衰竭與HLA無明顯相關性。

綜上所述，了解HLA與ESRD的遺傳相關性，不僅可為慢性腎病患者提供估計預后的指標，而且還能為等待腎移植的ESRD患者的供體選擇提供參數，降低腎移植的風險。并且能對ESRD的輔助診斷、分類及制定防治措施等提供依據。因此，擴大病例組樣本數量以及對導致ESRD的病因進行系統分類，是后續研究中亟需完善的工作。

[1]Franco C,Yoo W,Franco D,et a1.Predictors of end stage renal disease in African Americans with lupus nephritis[J].Bull NYU Hosp Jt Dis,2010，68(4):251-256.

[2]程良紅,吳國光,李興茂等.2210例江西籍漢族骨髓供者的HLAA、B、DRB1等位基因和單倍型頻率[J].臨床輸血與檢驗,2012,8(1):5-11.

[3]Caillat-Zucman S．Molecular mechanisms of HLA association with autoimmune diseases[J].Tissue Antigens,2009,73(1):1-8．

[4]Lehnhardt M,Muchlberger T,Kuhnen C,et al.Feasibility of chemise nsitivity testing in soft tissue sarcomas [J].World J Surg Oncol,2005,3(20):1-12．

[5]Karahan GE,Seyhun Y,Oguz FS,et al.Impact of HLA on the underlying primary diseases in Turkish patients with end-stage renal disease[J].Ren Fail,2009,31(1):44-49．

[6]Crispim JC,Mendes-Junior CT,Wastowski IJ,et al.HLA polymorphisms as incidence factor in the progression to end-stage renal disease in Brazilian patients awaiting kidney transplant[J].Transplant Proc,2008,40(5):1333-1336．

[7]Peyman PD,Naser F,Mohammad N.Protective and susceptible HLA Class I gene in patients with End-stage renal failure[J].Res J Biol Sci.2008,3(11):1344-1346．

[8]劉偉,李代紅.腎移植與HLA基因多態性的相關性［J］.廣東醫學,2013,34(9):1361-1364.

[9]楊寶成,王大明,高素青等.糖尿病視網膜病變與H LA-A、B和DRB1基因相關性的研究[J].實驗與檢驗醫學，2008,26(3):242-244.

[10]劉楠,袁方,梁飛,等.人類白細胞抗原多態性與慢性腎功能衰竭的遺傳易感性研究[J].軍事醫學科學院院刊,2009,33(1):33-36.