江西省表觀健康豬群攜帶豬鏈球菌狀況分析

陳福輝 ，程慧健 ，楊夢 ，潘歡弘 ，熊長輝 ，鄭翰

(1、江西省疾病預防控制中心，江西 南昌330029；2、中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所，北京 昌平102206)

豬鏈球菌屬于鏈球菌屬R群，是一種人畜共患病病原體。自1968年丹麥首次報道人感染豬鏈球菌以來，曾在中國香港、荷蘭、德國、加拿大、瑞典、法國等地也出現過豬鏈球菌感染人的病例，該病發病呈世界性分布[1]。據有關報道[2]：我國1998年和2005年分別在江蘇四川發生了大規模的血清2型豬鏈球菌感染人暴發，病死率分別高達56%和19%。還有研究發現一些非疫區豬鏈球菌的檢出率很高[3-6]。表觀健康豬群攜帶豬鏈球菌的現狀對豬的養殖、屠宰、加工、銷售等環節的從業人員構成了潛在的威脅，為了解和掌握江西省表觀健康豬群攜帶豬鏈球菌的狀況，為探索豬鏈球菌病更有效的預防和控制策略及方法，2011年至2012年，在曾經發生過豬鏈球菌感染人的景德鎮市和崇仁縣開展了豬攜帶豬鏈球菌的狀況調查。現將調查結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 調查地點及對象 選擇發生過豬鏈球菌感染人的景德鎮市和崇仁縣的一些屠宰場的表觀健康豬群以及周圍散養戶的表觀健康豬群。

1.2 調查內容 使用自制的無菌鋼絲棉拭子伸入豬咽喉部進行涂抹采集屠宰場的來源信息清楚的表觀健康豬群和散養戶的表觀健康豬群的鼻咽拭子，同時立即采集屠宰后生豬的扁桃體，進行豬鏈球菌病原分離鑒定。

1.3 主要試劑與儀器 DL2000 DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司(Takara)，2×Taq MasterMix購自康為世紀公司，Wizard Genomic DNA Purification Kit購自美國Promega公司，Lysozyme購自北京博奧拓科技有限公司，THB培養基購自美國BD公司，PCR引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，呋喃妥因購自生工生物工程(上海)有限公司，多粘菌素B購自北京陸橋技術有限責任公司，氨曲南購自南京都萊生物技術有限公司，胎牛血清(FBS)購自美國Invitrogen生命技術公司，PCR儀(SensoQuest Labcycler)購自德國Senso公司，凝膠成像系統(GEL Doc2000)購自美國Bio-Rad公司。

1.4 檢測方法 豬鏈球菌液體選擇性培養基為以THB固體粉末配置的濃度為30mg/ml的液體培養基，高壓滅菌后平衡至室溫，按指定濃度加入下列成分：呋喃妥因 15μg/ml，氨曲南 50μg/ml，多粘菌素 B 10μg/ml，胎牛血清(FBS)37.5μl/ml。 將采集后的豬鼻咽拭子放入上述肉湯中，置37℃，5%CO2增菌18h，挑適量增菌液劃線接種于StS平板[7]，培養24h后挑選可疑菌落接種于血平板，分純培養18h后，挑取單個菌落進行豬鏈球菌種基因(16s rRNA)及三種毒力基因PCR鑒定[8](表1)，豬鏈球菌種基因(16s rRNA)的反應條件為94℃預變性5min，94℃30s，60℃30s，72℃30s，25 個循環， 最后延伸 72℃5min；豬鏈球菌溶菌酶釋放相關蛋白編碼基因(mrp)的反應條件為 94℃預變性 5min，94℃30s，60℃30s，72℃30s，25個循環， 最后延伸 72℃5min；溶血素基因(sly)的反應條件94℃預變性5min，94℃30s，51℃60s，72℃90s，30 個循環， 最后延伸 72℃5min；細胞外蛋白因子編碼基因 (ef)的反應條件94℃預變性 5min，94℃30s，56℃30s，72℃30s，30 個循環，最后延伸72℃5min。最后挑豬鏈球菌種基因(16s rRNA)陽性菌株做血清玻片凝集試驗，即取一滴診斷血清于玻片上，用接種環挑取單個菌落與玻片上的診斷血清充分混合，靜止1min，觀察凝集反應情況，同時用生理鹽水作陰性對照。

2 結果

本次調查中，共采集到301份表觀健康豬的鼻拭子和扁桃體樣本，通過豬鏈球菌病原分離后，經豬鏈球菌種基因(16s rRNA)PCR鑒定，檢出2株豬鏈球菌(見圖1)，經血清分型為豬鏈球菌2型，經PCR檢測，其毒力基因mrp、sly、ef均為陰性。經統計，本次調查中表觀健康豬群攜帶豬鏈球菌的帶菌率為0.66%。

3 討論

注：圖中泳道 1：marker；2-9：菌株；10：陰性對照；11：陽性對照

人感染豬鏈球菌病多數是由于人直接接觸攜帶豬鏈球菌或病死的豬而引發感染的，而重癥病例多數則是由于感染了血清2型豬鏈球菌所致，其臨床表現主要為菌血癥、中毒性休克綜合征、壞死性筋膜炎、肌炎等，并且預后較差。近十余年來，歐美一些國家及我國的江蘇、四川等地區相繼報道過生豬屠宰人員、生肉加工人員發生感染血清2型豬鏈球菌的重癥病例。江西省2005年、2006年均在景德鎮市、崇仁縣接觸病死豬的人群中也出現過人感染豬鏈球菌的病例，但經流行病學調查發現他們接觸的病死豬均來自外地[9]。而隨后幾年，江西省境內再未出現人感染豬鏈球菌的病例，是我省豬攜帶豬鏈球菌水平下降還是豬鏈球菌攜帶的毒力基因水平降低或其他原因所致，尚不清楚，其原因有待進一步研究探討。目前檢測豬鏈球菌的傳統細菌培養、生化鑒定檢測方法的檢測時間較長，大約需要2～3d，不利于急性發病患者的及時診療，而近年來，隨著分子生物學檢測方法的引入應用，大大縮短了檢測時間，但此方法得不到藥敏試驗、毒力檢測、分子溯源等所需要的菌株，因此，應同時進行傳統的細菌培養與分子生物學檢測。

從本次調查結果來看，調查地點的表觀健康豬群攜帶豬鏈球菌的帶菌率僅為0.66%，而據江蘇省獸醫研究所報告，正常豬群中血清2型豬鏈球菌的帶菌率平均為42.6%[10]。新西蘭和澳大利亞的研究表明健康生豬攜帶豬鏈球菌的帶菌率為75%[11]。2009年中國人獸共患病學學報報道，從我國20個不同地區屠宰場采集248份豬扁桃體樣本中，檢測出14株豬鏈球菌，帶菌率為5.65%[12]。貴州省2006-2011年間6年的宿主動物監測數據顯示[13]：3969份表觀健康豬群鼻拭子和扁桃體樣本中未檢出豬鏈球菌。綜合上述報道數據比較分析，本次調查中我省兩個調查地點的表觀健康豬群攜帶豬鏈球菌的帶菌率較低，其原因可能與采集的樣本數量較少(301份)以及調查的地點選取數量較少僅為2個有關，這有待今后研究中進一步擴大調查范圍，增加樣本采集數量。有關文獻顯示[14]:我國不同地區的337份健康豬咽拭子標本，進行16SrRNA、gapdh基因PCR檢測，其檢出率無統計學差異，且其病原分離率亦無統計學差異。而我省本次調查中表觀健康豬群攜帶豬鏈球菌的帶菌率僅為0.66%，是否存在地區差異，這也有待進一步研究。

豬鏈球菌感染是動物二類傳染病，目前還沒有證據證明可以人傳人，人感染豬鏈球菌病是直接接觸感染[15]。我省2005-2006年間發生的人感染豬鏈球菌病例均由于接觸病死豬而引起感染，因此，應該繼續加強對表觀健康豬攜帶豬鏈球菌的監測，同時重點突出對表觀不健康豬和病死豬的監測與管理，以及加強生豬養殖、屠宰、販賣、銷售、加工等各環節相關從業人員的個人防護和健康教育，這些措施將對豬鏈球菌病有效防控起著重要作用。

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