泛耐藥鮑曼不動桿菌主動外排泵a d e B基因表達及耐藥性研究

徐軼 ，章白苓 ，章潔苓 ，尚姝 ，張楠 ，胡曉彥

(1、江西省人民醫院高干病房,江西 南昌330006；2、南昌大學第二附屬醫院檢驗科，江西 南昌330006)

由于抗菌藥物在臨床的廣泛使用，鮑曼不動桿菌已成為醫院感染的重要病原菌，檢出率和耐藥率不斷攀升，并且由單一耐藥到多重耐藥，甚至出現對臨床常用抗菌藥物呈泛耐藥現象[1]，鮑曼不動桿菌耐藥機制十分復雜，近年來對修飾酶、降解酶和作用靶位的改變等方面耐藥機制的研究較多，而對主動外排系統在鮑曼不動桿菌耐藥機制中的作用研究甚少。主動外排系統由細菌胞膜介導抗菌劑外排的蛋白組成，是導致細菌多重耐藥的重要原因[2，3]。為了解鮑曼不動桿菌主動外排泵基因，探討其耐藥機制，我們對主動外排泵adeB基因表達水平與臨床分離的泛耐藥鮑曼不動桿菌(pan-drug resistance Acinetobacter baumannii，PRABA)耐藥性的關系進行研究，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集南昌大學第二附屬醫院2010年1月至2011年12月臨床分離的PRABA菌36株,江西省人民醫院2010年1月至2011年12月臨床分離的PRABA菌14株，共50株。標本種類包括痰液30株、傷口分泌物13株、尿液5株、血液2株。同一患者的重復標本按1株計算。其中ICU20株，呼吸內科15株，神經外科10株，骨科5株，4株PSABA菌株。所有菌株經Vitek2-compact微生物鑒定儀鑒定。質控菌株：銅綠假單胞菌ATCC 27853，大腸埃希菌ATCC 25922。

1.1.2 主要儀器及試劑 Vitek2-Compact全自動微生物鑒定儀(法國生物梅里埃公司)；9700PCR擴增儀(美國ABI公司)；凝膠成像分析系統(英國GENE GENIUS 公司)。 氧氟沙星(OFLX)、慶大霉素(GEN)、四環素(TET)、頭孢噻肟(CTX)均購自中國藥品生物品檢定所；亞胺培南(IPM杭州默沙東有限公司)；泵抑制劑羰基氰氯苯腙 (CCCP)，購自美國Sigma公司。RNA提取Trizol試劑盒為美國Molecular Research Center公司產品，聚合酶鏈反應(PCR)及逆轉錄PCR(RT-PCR)試劑盒為美國Promega公司產品，引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 外排泵表型檢測 用瓊脂稀釋法檢測5種抗菌藥物 OFLX、GEN、TET、CTX、IPM 的 MIC。 同時制備含有CCCP的MH瓊脂，CCCP濃度20μg/ml，同樣用瓊脂稀釋法檢測上述5種抗菌藥物對各菌株的MIC值。加入CCCP后的MIC值下降≥4倍時，則可判定外排泵表型陽性[4]。

1.2.2 adeB基因檢測 細菌DNA提取采用煮沸法。 引物合成：P1：5′-AAA GAC TTC AAA GAG CGG ACT A-3′;P2：5′-TCA CGC ATT GCT TCA CCG-3′。 反應總體積 50μl；Taq 酶 25μl，上、下游引物 P1、P2 各 2μl，模板 DNA 2μl，雙蒸水 19μl。 反應條件：94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 1min，72℃ 1min，30個循環；72℃7min。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像系統下成像分析結果。隨機選取10個PCR陽性產物送上海生工生物公司測序。

1.2.3 adeB基因表達水平檢測 細菌總RNA提取按試劑盒說明進行。RT-PCR擴增引物為P1和P2，內參基因recA擴增引物序列為5′-TTT CAC AAC CCG ACA ATG-3′和 5′-TGC CTC GCT CAT AAG ACG-3′。操作方法參照說明書進行一步法RT-PCR 反應。 反應條件：45℃ 45min；95℃ 2min；94℃ 30s，55℃ 1min，72℃ 1min，30 個 循 環 ；72℃7min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像系統成像后用美國Quantity One 4.4軟件分析所得相對灰度值。

1.2.4 統計前處理 用WHO NET5.4和SPSS13.0統計軟件進行數據分析，計量資料以(x±s)表示，兩組比較采用t檢驗，P<0.05時差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外排泵表型檢測結果 50株PRABA菌株對OFLX、GEN、TET、CTX、IPM 的 MIC 值范圍分別為36 ～128μg/ml、2048 ～8192μg/ml、1024 ～2048μg/ml、512～1024μg/ml和 4～128μg/ml。

以加入CCCP的MIC值比不加降低4倍或以上作為外排表型陽性的判定標準，OFLX 45株陽性、GEN 50株全部陽性、TET 42株陽性、CTX 50株全部陽性、IPM 45株陽性。在僅含 20μg/ml CCCP的瓊脂平板中，所有試驗菌株均生長良好，表明20μg/ml CCCP對細菌生長無抑制作用。

2.2 adeB基因檢測結果 50株PRABA菌和4株PSABA菌株產物均檢測到目的基因adeB基因條帶，片段約為675bp，ATCC 27853未見擴增片段。結果見圖1(部分結果圖)。隨機選取10個陽性PCR產物經測序后，在GenBanK基因庫中比對分析，7號菌株結果與登陸號NC009085.1的菌株親緣關系最近，其同源性為100%，3號菌株結果與登陸號NC009085.1的菌株親緣同源性為98%，其他菌株同源性為99%。見圖2。

圖1 adeB基因PCR擴增產物電泳結果

圖2 adeB基因測序圖

2.3 adeB基因表達水平檢測結果 以adeB和recA電泳條帶灰度值的比值(adeB/recA)表示adeB相對表達水平，PRABA組和PSABA組細菌株adeB/recA 計算結果分別為(3.52±0.68)和(0.85±0.04)，差異有統計學意義(P<0.01)。

3 討論

鮑曼不動桿菌廣泛分布于自然界和醫院環境，是醫院感染的重要病原菌[5]，鮑曼不動桿菌作為醫院內感染的重要病原菌已引起世界范圍內的廣泛重視，隨著β-內酰胺類抗生素和第三代頭孢菌素等廣譜抗生素的廣泛應用，誘導了大量耐藥株的產生，由單一抗生素耐藥發展到多重耐藥，甚至出現了泛耐菌株，給抗感染治療帶來巨大困難[5，6]。從本組50株泛耐藥鮑曼不動桿菌菌株來源，主要來源于ICU、呼吸內科、神經外科和骨科，標本主要為痰液和傷口分泌物，ICU、呼吸內科、神經外科鮑曼不動桿菌分離率高，與這3個科室住院患者住院時間長，大多有嚴重疾病和長期使用廣譜抗生素有關。

鮑曼不動桿菌耐藥機制復雜，其中細菌的主動外排泵系統是介導細菌多重藥物耐藥的主要機制[7]，依據氨基酸序列的同源性可分為5個主要超家族[8]，包括ATP結合盒超家族(ABC)、主要易化子超家族(MFS)、耐藥節結化分化家族(RND)、多藥及毒性化合物外排家族(MATE)和小多重耐藥性家族(SMR)。

Sophie Magnet等在一株鮑曼不動桿菌多重耐藥株BM 4454中發現存在adeABC基因簇編碼的泵出系統，經證實，AdeABC是鮑曼不動桿菌所特有[9]。AdeABC外排泵隱藏在野生的鮑曼不動桿菌中，其作用受到AdeRS調控[10],AdeB蛋白包含12個跨膜片段，此類轉運蛋白對多種抗生素有轉運作用，屬于RND類[11]。我們研究發現，臨床分離的泛耐藥株和敏感株均能檢測到adeB基因[12，13]。通過進一步檢測該基因mRNA的表達水平，發現泛耐藥菌株表達水平顯著高于敏感株[13，14]，這種編碼外排泵的基因高表達可能導致了該菌的泛耐藥和多重耐藥。外排泵基因adeABC位于鮑曼不動桿菌的染色體基因組中，無論敏感或耐藥菌株均普遍存在，而在敏感菌株中不表達或低表達，可能與泵基因上游的調控序列有關。

本研究中通過PCR擴增受試菌株的adeB基因，測序分析顯示其序列與GenBank上登陸的登陸號NC009085.1adeB的同源性為98.0%～100%，證實擴增產物為adeB基因。

CCCP作為一種外排耐藥系統抑制劑，是一種抑制質子轉運的解偶聯劑，可以阻斷菌體表面蛋白能量的供應，使外排泵無法正常工作，藥物不被外排而蓄積于菌體內，恢復細菌對藥物的敏感性[15]。我們研究試驗表明，PRABA菌株加入CCCP 20μg/ml后，四環素、氧氟沙星、亞胺培南、頭孢噻肟、慶大霉素MIC值小于原值的1/4或1/4以下，分別為84%～100%，以慶大霉素下降最明顯。這說明CCCP外排泵抑制劑對逆轉鮑曼不動桿菌耐藥行之有效，但是對于不同抗菌藥物的耐藥性逆轉程度有所差異。表明鮑曼不動桿菌中存在主動外排機制，鮑曼不動桿菌的高度耐藥與藥物主動外排系統密切相關。

綜上所述，主動外排系統在介導鮑曼不動桿菌多重耐藥和泛耐藥中發揮重要作用，編碼基因adeB高表達導致鮑曼不動桿菌同時對幾類藥物耐受，泵抑制劑能夠部份逆轉這種耐受，但是，有關外排泵的底物與耐藥表型的關系還未完全明確，因此，應加強鮑曼不動桿菌耐藥機制的基礎研究，改進藥物設計，研發新型藥物，為臨床更好地選擇藥物和更有效地治療疾病提供理論基礎。

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