金錢草膠囊中槲皮素人體藥代動力學(xué)研究＊

王洪銳，陳玩珊 ，馮雪科 ，吳毓朝，原文鵬

(1.廣東省深圳市福永人民醫(yī)院，廣東 深圳 518103; 2.廣東省深圳市人民醫(yī)院·暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東深圳 518020)

金錢草 Lysimachia christinae Hance味苦、酸，微寒，歸肝、膽、腎、膀胱四經(jīng)，有清熱解毒、利尿排石、活血散瘀的功效[1－3]。現(xiàn)代藥理研究表明，金錢草制劑口服可用于治療肝、膽、泌尿系結(jié)石，膽囊炎，黃疸性肝炎，水腫，跌打損傷，毒蛇咬傷，毒蕈及藥物中毒;外用治療化膿性炎癥、燒燙傷[1－5]。金錢草制劑不良反應(yīng)較少，臨床應(yīng)用廣泛[3]。課題組前期建立了金錢草膠囊中有效成分槲皮素(quercetin)的血藥濃度測定方法[6]。本試驗(yàn)中選擇6名健康志愿者，研究了金錢草膠囊中槲皮素的人體藥代動力學(xué)，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀(G1311A四元泵，G1322A真空脫氣機(jī)，G1315B－DAD檢測器，D1316A柱溫箱，rheodyne－7725i進(jìn)樣器，ChemStation色譜工作站);AG285型電子天平(梅特勒托利多儀器有限公司);XW－80A型旋渦混合器(原上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠);KQ5200DB型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);高速離心機(jī)(雅培公司);PHS－3C型數(shù)字pH計(上海精科雷磁儀器廠)。金錢草膠囊(四川綠葉寶光藥業(yè)有限公司，批號為120203A，規(guī)格為每粒0.4 g);槲皮素對照品[供高效液相色譜(HPLC)法測定用，中國食品藥品檢定研究院，批號為100081－200907，含量為96.5%];甲醇(天津四友精細(xì)化工有限公司)、乙腈(天津四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)均為色譜純;β－葡萄糖苷酸酶(H－2型)、硫酸酯酶(H－1型)，均為美國Sigma公司產(chǎn)品;磷酸、乙酸乙酯及其他試劑均為分析純，水為注射用水。所有試劑及緩沖液使用前均經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)方案

受試者選擇及給藥方法:6名健康志愿者，男5名，女1名;平均年齡(24.8 ±1.6)歲，平均體重(61.5±7.3)kg，平均身高(166.3 ±4.6)cm，均在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi);不吸煙，不嗜酒，身體健康，無心、肝、腎、肺、消化道系統(tǒng)等疾病史，精神狀態(tài)正常，無金錢草膠囊等藥物過敏史;試驗(yàn)前3周未使用任何藥物。受試者自愿參加試驗(yàn)，并簽署知情同意書，體檢及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果均正常，試驗(yàn)內(nèi)容均經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)。志愿者受試前隔夜禁食12 h，次日晨空腹單次口服金錢草膠囊1.6 g，用200 mL溫開水吞服。

觀察指標(biāo):分別于服藥前及服藥后 0，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，8.0 h 采集上肢靜脈血 4 mL，置干燥管中，靜置30 min，以10000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min。取上清液，置1.5 mL離心管中，密封，做好標(biāo)記，置－20℃保存?zhèn)溆谩０磾M訂方法進(jìn)樣測定。試驗(yàn)期間禁煙、酒和劇烈運(yùn)動，不使用其他任何藥物，服藥后2 h進(jìn)食統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)餐。試驗(yàn)期間，由臨床醫(yī)師觀察耐受性和不良反應(yīng)。

2.2 血藥濃度測定[6]

色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn):色譜柱為Kromasil C8柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相為甲醇 －乙腈 －0.4% 磷酸溶液(40∶10∶50);流速為1 mL/min;柱溫為30℃;檢測波長為360 nm;進(jìn)樣量為20 μL。在此色譜條件下，槲皮素的保留時間為8.8 min，理論板數(shù)按槲皮素計算不低于3 000，峰對稱因子(AS)為 1.08，色譜圖見圖 1。

圖1 高效液相色譜圖

血漿樣品的提取與分離:進(jìn)樣分析前，血漿樣品室溫自然解凍，精密量取0.5 mL，置10 mL具塞錐形離心管中，加入40 μL β －葡萄糖苷酸酶，調(diào) pH 至 4.5～5.0，旋渦混合 30 s，37℃水解8 h后，加入乙酸乙酯6 mL(分2次加入，每次3 mL)，分別旋渦提取5 min，合并萃取液，以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取乙酸乙酯層，50℃水浴氮?dú)饬鞔蹈桑瑲堅?00 μL甲醇溶解，旋渦30 s，再以相同轉(zhuǎn)速離心3 min，取20 μL進(jìn)樣測定。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備:取槲皮素對照品溶液10 mL，分別置具塞錐形離心管8支，精密加入健康體檢者混合空白血漿0.5 mL。除空白管外，其余每支管精確加入不同質(zhì)量濃度的槲皮素對照品溶液20 μL，旋渦混合 30 s，得質(zhì)量濃度分別為 0.08，0.16，0.80，2.40，4.00，8.00，12.00 μg/mL 的系列血漿樣品，按預(yù)處理方法處理后進(jìn)樣分析，以槲皮素峰面積(A)對質(zhì)量濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 A=385.85 C －32.518(r=0.998 8)。結(jié)果表明，槲皮素質(zhì)量濃度在0.08～12 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3 試驗(yàn)結(jié)果

將不同時間的血藥濃度數(shù)據(jù)采用DAS ver 2.1.1藥動學(xué)程序計算藥代動力學(xué)參數(shù)。以Simplex法在DAS藥動學(xué)程序中進(jìn)行曲線擬合，口服金錢草膠囊1.6 g的血藥濃度－時間曲線符合二室房室模型(Wi=1/C，AIC=9.043)，平均藥 －時曲線見圖 2。6名受試者口服金錢草膠囊1.6 g后的主要藥代動力學(xué)參數(shù)見表1。

3 討論

圖2 口服金錢草膠囊1.6 g后的平均藥－時曲線

表1 口服金錢草膠囊1.6 g后的主要藥代動力學(xué)參數(shù)

中藥藥代動力學(xué)的研究與發(fā)展對于中藥新藥設(shè)計，改進(jìn)中藥劑型，提供高效、速效、長效、低毒副作用的中藥制劑，特別是對于指導(dǎo)臨床合理用藥、推動中藥現(xiàn)代化及中藥走向世界都具有重大的現(xiàn)實(shí)意義[6]。金錢草膠囊為中藥金錢草的單方制劑，槲皮素是金錢草的主要有效成分，主要以苷的形式存在。

槲皮素屬多羥基黃酮類化合物，本研究中選用C8柱，配制質(zhì)量濃度為4 μg/mL的槲皮素對照品甲醇溶液，在200～700 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果在360～374 nm波長處有明顯吸收。參照文獻(xiàn)[6－7]及2010年版《中國藥典(二部)》[7]將檢測波長選定為360 nm，溶劑、內(nèi)源性物質(zhì)及金錢草可能的代謝物均無干擾。槲皮素的測定多以甲醇、乙腈和稀磷酸為基礎(chǔ)流動相[6－10]，本研究中通過試驗(yàn)最終選擇以甲醇－乙腈－0.4%磷酸溶液(40∶10∶50)為流動相，保留時間約為8.8 min，峰形、靈敏度和分離效果好。血漿樣本的處理采用酶水解后溶劑萃取方式，通過優(yōu)化水解條件、提取溶劑、提取方式等可獲得較好效果，色譜峰分離度好，內(nèi)源性物質(zhì)無干擾，專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、線性范圍及最低定量檢測限均符合要求，不足之處是水解時間較長。

本研究結(jié)果顯示，金錢草人體藥代動力學(xué)參數(shù)的特征為分布相(α =1.056)大于消除相(β =0.704)，符合二室房室模型的特點(diǎn);消除半衰期(t1/2β)為 0.985 h，達(dá)峰時間(Tmax)和峰濃度(Cmax)分別為3 h和2.308 85 mg/L，符合二室房室模型(Wi=1/C，AIC=9.043)。本研究結(jié)果顯示，HPLC－UV法可用于金錢草膠囊人體藥代動力學(xué)和生物等效性分析研究。

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