白藜蘆醇對人胚肺成纖維細胞株MRC-5生長的抑制作用

劉理靜，錢 紅，張 平，王在巖

(1.湖南醫藥學院臨床醫學系，湖南 懷化 418000；2.南華大學附屬第一醫院呼吸內科，湖南 衡陽 421001)

白藜蘆醇對人胚肺成纖維細胞株MRC-5生長的抑制作用

劉理靜1，錢 紅1，張 平2，王在巖2

(1.湖南醫藥學院臨床醫學系，湖南 懷化 418000；2.南華大學附屬第一醫院呼吸內科，湖南 衡陽 421001)

目的 探討白藜蘆醇(Res)對人胚肺成纖維細胞生長的抑制作用及相關機制。方法 以人胚肺成纖維細胞MRC-5為研究對象，分別予20 μL二甲基亞砜(DMSO)及0、12.5、25、50、100、200 μmol·L-1Res處理細胞24、48、72 h，通過MTT法分析細胞增殖抑制率。另外，以20 μL DMSO(溶媒組)及 50、100 μmol·L-1Res孵育細胞48 h，采用流式細胞術檢測細胞周期和凋亡率，行原位缺口末端標記法(TUNEL)測定細胞凋亡指數(AI)，應用熒光實時定量PCR和Western blot分別檢測細胞周期蛋白D1(cell cycle protein D1, Cyclin D1)、細胞周期蛋白依賴激酶4(cyclin-dependent kinase 4, CDK4)mRNA與蛋白表達，Western blot檢測Bcl-2、Bax蛋白表達。結果 隨著Res濃度的升高和處理時間的延長，細胞增殖抑制率逐漸增加(P<0.01)。在共同培養48 h后，50、100 μmol·L-1Res處理組S、G2/M期DNA比例及Cyclin D1、CDK4 mRNA與蛋白表達水平、Bcl-2蛋白表達水平降低，而G0/G1期DNA比例、AI、凋亡率及Bax蛋白表達水平增加，與溶媒組比較，差異均有顯著性(P<0.01)，并且100 μmol·L-1Res 效果強于50 μmol·L-1(P<0.01)。結論 Res能抑制MRC-5細胞增殖，其機制可能與阻礙細胞周期進展及促進細胞凋亡有關。

白藜蘆醇；人胚肺成纖維細胞；增殖；細胞周期；凋亡；細胞周期蛋白D1

肺纖維化(pulmonary fibrosis)是以肺泡間質炎性細胞浸潤、成纖維細胞異常增殖和膠原蛋白沉積為特征的免疫介導的慢性炎癥性疾病，是許多病因不同的肺間質疾病的共同結局，臨床表現主要為進行性呼吸困難，患者最終因呼吸衰竭而死亡，目前仍缺乏有效的治療手段，因此，尋找抗肺纖維化的有效藥物已成為當前醫學的迫切需要[1-3]。肺成纖維細胞由胚胎時期的間充質細胞分化而來，構成肺臟結締組織中主要的細胞成分，在病理條件下，這些細胞也是肺纖維化形成過程中的最重要效應細胞，一方面，通過自身不斷增殖合成大量膠原蛋白參與肺纖維化的進程，另一方面，分泌多種細胞因子促進肺纖維化的進展[4]。白藜蘆醇(resveratrol, Res)是從植物中提取的一種非黃酮類多酚化合物，分子式為C14H12O3，具有廣泛的藥理活性。本課題組前期研究顯示，Res對博萊霉素所致的大鼠肺纖維化具有良好的治療作用[5-8]。近年眾多研究證實[9-11]，Res也有較強的抗心臟成纖維細胞及腫瘤細胞增殖效應。然而，Res對肺成纖維細胞生長的影響仍不清楚。因此。本研究以人胚肺成纖維細胞MRC-5為研究對象，觀察Res對MRC-5細胞增殖、細胞周期進展和凋亡的影響，旨在進一步闡述Res抗肺纖維化的分子機制，從而為其臨床應用提供更多的理論基礎和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料人胚肺成纖維細胞株(MRC-5)由中國科學院上海細胞庫提供。Res購于西安天一生物技術有限公司，產品批號：070115，純度≥98%。新生胎牛血清及RPMI 1640培養基購于Gibco公司。四甲基偶氮唑藍[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetra-zolium bromide, MTT]試劑盒購自江蘇碧云天公司。二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)、碘化丙啶由美國 Sigma公司提供。原位缺口末端標記法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)凋亡檢測試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。RNA提取試劑TRIzol購自美國Invitrogen公司。逆轉錄試劑盒購于Ferments公司。兔抗人細胞周期蛋白D1(cell cycle protein D1, Cyclin D1)、細胞周期蛋白依賴激酶4(cyclin-dependent kinase 4, CDK4)、Bcl-2、Bax、β-actin抗體購于美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 MRC-5細胞復蘇后接種于含10%新生胎牛血清的RPMI 1640培養基中，置入37℃、5%CO2培養箱進行細胞培養，待細胞生長至融合狀態后，以0.25%的胰蛋白酶消化，并進行傳代培養，當培養細胞達到一定數量，且呈現對數生長時待用。

1.2.2 細胞分組 取處于對數生長期的MRC-5細胞，制成單細胞懸液，并接種于96孔板中，每孔1×106個細胞，約 100 μL，然后加入0.18 mL培養液，繼續培養 24 h，待細胞貼壁后分為溶媒組(DMSO)和Res(溶解于DMSO中)處理組，每組平行設置5個樣本。

1.2.3 MTT檢測細胞增殖 Res處理組加入0(DMSO)、12.5、25、50、100、200 μmol·L-1的Res各20μL，溶媒組加入相同體積的DMSO，共同培養24、48、72 h后，滴加已配好的20 μL MTT溶液(5g·L-1)，繼續孵育4 h，然后結束培養，將每孔內的培養上清液小心棄去，加入150 μL的DMSO，輕輕振蕩約10 min，使結晶能夠完全溶解，以DMSO調零，在Bio-Tek808酶標儀上，570 nm波長處測定每個孔的吸光度(optical density, OD)值，計算不同濃度Res的細胞增殖抑制率：細胞增殖抑制率/%=(溶媒組OD值-Res處理組OD值)/溶媒組OD值×100%。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞周期和凋亡率 Res處理組分別加入50、100 μmol·L-1的Res 20 μL，溶媒組加入20 μL DMSO，孵育48 h后，PBS洗細胞3次，并用胰蛋白酶消化，1 500 r·min-1離心3 min，重復以上操作3次，收集細胞沉淀，加70%并4℃預冷的乙醇固定過夜，24 h后離心去上清，加入1mL碘化丙啶染液，4℃避光30 min，用400目的篩網過濾1次。采用FACS420流式細胞儀(美國Beckerman coulter 公司)進行檢測，計算細胞周期各時相 DNA的百分含量及凋亡率。

1.2.5 TUNEL檢測細胞凋亡 經20 μL DMSO以及50、100 μmol·L-1Res分別處理MRC-5細胞48 h后，采用TUNEL檢測MRC-5細胞凋亡。凋亡細胞表現為胞核中出現棕黃色顆粒。在400高倍視野下，每張切片隨機取5個區域，計數每個區域中細胞核數及凋亡陽性細胞核數，取其平均值，按下式計算凋亡指數(apoptosis index, AI)，AI/%=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.2.6 熒光實時定量PCR 取經20 μL DMSO以及50、100 μmol·L-1Res干預48 h 的MRC-5細胞，采用TRIzol試劑提取總RNA，并溶解于無RNase的水中，通過紫外分光光度計測定每個樣本總RNA 的A260/280，其比值均在1.8～2.0之間，符合實驗要求。取總RNA 2 μg，按照逆轉錄試劑盒提供的方法合成cDNA。Cyclin D1、CDK4、β-actin引物序列參照文獻[12]，由上海生工生物工程公司合成，其中Cyclin D1引物序列：上游5′-CTCCTGGTGAACAAGCTCAAGT-3′，下游5′-GCGGTAGTAGGACAGGAAGTTG-3′，PCR擴增產物長度為258 bp；CDK4引物序列：上游5′-GGGACCGTCAAGCTGGCTGA-3′，下游5′-TCGAGGCCAGTCGTCTTCTG-3′，PCR擴增產物長度為267 bp；β-actin引物序列：上游5′-CCCACACTGTGCCCATCTACG-3′，下游5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTCC-3′，PCR擴增產物長度為205 bp。取10 μL逆轉錄產物進行PCR反應，反應條件：94℃預變性3 min，94℃變性40 s，62℃復性40 s，72℃延伸1 min，總共35個循環。用ΔΔCt值法，以β-actin為內參照，定量Cyclin D1、CDK4 mRNA的表達水平。

1.2.7 Western blot 細胞處理過程同上，收集細胞，通過三去污裂解液將細胞勻漿，吸出上清液，并進行蛋白定量。常規制備SDS-PAGE膠，20 μg蛋白質樣品上樣，在70 V電壓下電泳1.5 h，轉移至PVDF膜。50 g·L-1脫脂奶粉室溫封閉，分別加入1 ∶500兔抗人Cyclin D1、CDK4、Bcl-2、Bax、β-actin抗體，4℃孵育過夜后，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1 ∶2 500)室溫孵育1 h，ECL 顯色，暗室曝光。利用Labwork凝膠圖像分析系統對膠片進行掃描，得出灰度值，目的蛋白(Cyclin D1、CDK4、Bcl-2、Bax)表達水平=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。

2 結果

2.1 Res對MRC-5細胞增殖的抑制作用通過MTT法分析Res干預對MRC-5細胞增殖的影響(Fig 1)，發現隨著Res濃度的升高和處理時間的延長，其對MRC-5細胞增殖的抑制率逐漸增加，在同一Res濃度(12.5、25、50、100、200 μmol·L-1)組內，干預24、48、72 h后細胞增殖抑制率兩兩之間比較，差異均有顯著性(P<0.01)。同樣，在同一時點內，各Res處理組細胞增殖抑制率比較，差異均有顯著性(P<0.01)，見Fig 1。

2.2 Res對MRC-5細胞周期的影響以50、100 μmol·L-1Res 20 μL分別處理MRC-5細胞48 h后，采用流式細胞術分析細胞周期各時相 DNA比例，結果顯示，50、100 μmol·L-1Res處理組G0/G1期DNA比例增加， S、G2/M期DNA比例降低，與溶媒組比較，差異均有顯著性(P<0.01)，而且100 μmol·L-1Res處理組G0/G1期DNA比例高于50 μmol·L-1Res處理組(P<0.01)，但S、G2/M期DNA比例低于50 μmol·L-1Res處理組(P<0.01)，見Fig 2、3。

Fig 1 Inhibitory rate of cellular proliferation in MRC-5 cells treated with various concentration of Res for different time ±s, n=5)

Fig 2 Cell cycle distribution of MRC-5 cells among groups

2.3 Res對MRC-5細胞Cyclin D1、CDK4表達的影響為了進一步闡明Res使細胞生長停滯在G0/G1期的機制，通過熒光實時定量PCR和Western blot測定MRC-5細胞中Cyclin D1、CDK4表達，如Fig 4、5所示，與溶媒組相比，50、100 μmol·L-1Res處理組Cyclin D1、CDK4 mRNA與蛋白表達水平下調(P<0.01)，此外，100 μmol·L-1Res處理組Cyclin D1、CDK4 mRNA與蛋白表達水平較50 μmol·L-1Res處理組下降(P<0.01)。

Fig 3 DNA contents of G0/G1, S and G2/M phases

1: Medium group; 2: 50 μmol·L-1Res-treated group; 3: 100 μmol·L-1Res-treated group.**P<0.01vsmedium group;##P<0.01vs50 μmol·L-1Res-treated group

Fig 4 Expression of Cyclin D1 and CDK4 mRNA in

1: Medium group; 2: 50 μmol·L-1Res-treated group; 3: 100 μmol·L-1Res-treated group.**P<0.01vsmedium group;##P<0.01vs50 μmol·L-1Res-treated group

2.4 Res對MRC-5細胞凋亡的影響TUNEL染色發現，溶媒組僅有少量MRC-5細胞凋亡，給予50、100 μmol·L-1Res處理細胞48 h后，AI明顯上升，與溶媒組比較，差異均有顯著性(P<0.01)，而且100 μmol·L-1Res處理組AI高于50 μmol·L-1Res處理組(P<0.01)，見Fig 6。此外，通過流式細胞術檢測各組MRC-5細胞凋亡率，其變化趨勢與AI相似，見Fig 7、8。

Fig 5 Expression of Cyclin D1 and CDK4 proteins in

1: Medium group; 2: 50 μmol·L-1Res-treated group; 3: 100 μmol·L-1Res-treated group.**P<0.01vsmedium group;##P<0.01vs50 μmol·L-1Res-treated group

2.5 Res對MRC-5細胞Bcl-2、Bax蛋白表達的影響通過Western blot測定MRC-5細胞Bcl-2、Bax蛋白表達，由Fig 9可知，經20 μL的50、100 μmol·L-1Res孵育MRC-5細胞48 h后， Bcl-2蛋白表達水平下調，Bax蛋白表達水平上調，與溶媒組比較，差異均有顯著性(P<0.01)，另外，100 μmol·L-1Res處理組Bcl-2蛋白表達水平較50 μmol·L-1Res處理組減少(P<0.01)，而Bax蛋白表達水平較50 μmol·L-1Res處理組升高(P<0.01)。

3 討論

Res廣泛存在于葡萄、花生、虎杖多種植物體內，是植物在受到紫外線照射、外來病菌入侵等不利條件下產生的一種植物抗毒素。隨著研究的深入，目前已發現Res具有多種藥理活性，如抗腫瘤、抗炎、抗纖維化、降壓、抗血小板聚集、抗氧化以及抗細菌和真菌感染等[13-15]。張黎等[16]用Res處理小鼠胚胎成纖維細胞，發現Res能明顯抑制細胞增殖。另外，Res給藥呈劑量依賴性地阻礙人皮膚肥厚性瘢痕組織中成纖維細胞的生長[17]。本研究應用MTT法分析Res干預對MRC-5細胞增殖能力的影響，發現隨著Res濃度的升高和處理時間的延長，細胞增殖抑制率逐漸增加，表明Res在體外能抑制MRC-5細胞增殖，并且具有時效和量效關系。

Fig 7 MRC-5 cell apoptosis detected by flow cytometry among groups

Fig 8 Comparison of apoptotic rate in MRC-5 cells

1: Medium group; 2: 50 μmol·L-1Res-treated group; 3: 100 μmol·L-1Res-treated group.**P<0.01vsmedium group;##P<0.01vs50 μmol·L-1Res-treated group

Fig 9 Expression of Bcl-2 and Bax proteins in

1: Medium group; 2: 50 μmol·L-1Res-treated group; 3: 100 μmol·L-1Res-treated group.**P<0.01vsmedium group;##P<0.01vs50 μmol·L-1Res-treated group

細胞周期是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束所經歷的全過程，分為間期(G1、S、G2)與分裂期(M)兩個階段，與細胞增殖密切相關。已有研究證實，Res與體外培養的神經母細胞瘤 SH-SY5Y細胞共同孵育，能夠阻止 G1期細胞進入 S期[18]。本實驗結果顯示，采用50、100 μmol·L-1Res處理MRC-5細胞48 h后，G0/G1期DNA比例升高，而S、G2/M期DNA比例降低，并且100 μmol·L-1Res作用強于50 μmol·L-1，提示Res可阻止MRC-5細胞周期的正常進行，使細胞停滯于G0/G1期，減少了DNA合成和有絲分裂，從而發揮抑制細胞增殖的作用。Cyclin D1為G1期的正性調控蛋白，當其與 CDK4結合后，驅使細胞通過R(restriction point)點，由G1期進入S期而實現細胞分裂增殖。陳加順等[19]報道，Res作用于人肺腺癌 A549細胞后，Cyclin D1表達明顯下調，細胞活性降低。為了進一步探討Res誘導MRC-5細胞周期阻滯于G0/G1期的機制，本研究采用熒光實時定量PCR和Western blot檢測經50、100 μmol·L-1Res處理后的MRC-5細胞Cyclin D1、CDK4表達，結果發現，隨著Res濃度的升高，Cyclin D1、CDK4 mRNA與蛋白表達水平逐漸減少，因此，Res通過下調Cyclin D1、CDK4表達使細胞不能通過R點，這可能是Res抑制MRC-5細胞周期進展的重要機制。

細胞凋亡又稱為程序性死亡，它是由體內外因素觸發細胞內預存的死亡程序而引起細胞死亡的方式。Bcl-2、Bax被認為是調控凋亡最重要的2個因子，Bcl-2抑制細胞凋亡，Bax則促進細胞凋亡。最近，顧生玖等[20]發現，漢黃芩素通過下調Bcl-2表達及上調Bax表達誘導肝癌細胞HepG-2凋亡。Liu等[21]報道，Res通過激活caspase-3、9,增加人胃癌SGC7901細胞凋亡率。因此，Res誘導細胞凋亡特性可能對MRC-5細胞增殖具有一定的抑制作用。的確，將50、100 μmol·L-1Res加入MRC-5細胞后，AI、凋亡率和Bax表達水平明顯增加，Bcl-2表達水平降低，并且濃度越高，效果越明顯，表明Res通過減少Bcl-2/Bax比例刺激MRC-5細胞凋亡，從而發揮抗MRC-5細胞增殖效應。

綜上所述，本研究結果證實了Res能有效抑制體外培養的人胚肺成纖維細胞MRC-5生長，一方面通過下調Cyclin D1、CDK4表達阻滯細胞周期進展，另一方面通過降低Bcl-2表達及增加Bax表達促進細胞凋亡，這從新的視角闡明了Res抑制肺纖維化發生、發展的機制。因此，深入開展Res抗肺纖維化作用的研究可能為這種疾病的治療帶來新的思路和希望。

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Inhibitory effects of resveratrol on human pulmonary fibroblast line MRC-5 growth

LIU Li-jing1, QIAN Hong1, ZHANG Ping2,WANG Zai-yan2

(1.DeptofClinicalMedicine,HunanUniversityofMedicine,HuaihuaHunan418000,China；2.DeptofRespiration,theFirstAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,HengyangHunan421001,China)

Aim To explore the inhibitory effects of resveratrol (Res) on human pulmonary fibroblast growth, and its related mechanisms. Methods Human pulmonary fibroblasts MRC-5 were culturedinvitroas research object. These cells were inoculated with 20 μL dimethyl sulfoxide (DMSO) as well as 0, 12.5, 25 50, 100 and 200 μmol·L-1Res for 24, 48 and 72 h, respectively. Inhibitory rate of cellular proliferation was analyzed by MTT. In addition, these cells were treated with 20 μL DMSO (medium group) as well as 50 and 100 μmol·L-1Res for 48 h, respectively. Subsequently, cell cycle and apoptotic rate were measured using flow cytometry. Apoptosis index (AI) was detected through terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL). The mRNA and protein expression of cell cycle protein D1 (Cyclin D1) and cyclin-dependent kinase 4 (CDK4) was detected through fluorescence real-time quantitative PCR and Western blot, respectively. Western blot was used to measure the protein expression of Bcl-2 and Bax. Results With the increase of Res concentrations and prolongation of treated time, inhibitory rate of cellular proliferation was gradually elevated (P<0.01). After 48 h of co-culture, DNA ratio of S and G2/M periods, mRNA and protein levels of Cyclin D1 and CDK4, and Bcl-2 protein levels were significantly decreased while DNA ratio of G0/G1period, AI, apoptotic rate and Bax protein levels were significantly increased in 50 and 100 μmol·L-1Res-treated groups as compared to medium group (P<0.01). Moreover, the effects 100 μmol·L-1Res were better than those of 50 μmol·L-1Res (P<0.01). Conclusion Res can suppress the proliferation of MRC-5 cells, which may be associated with blockade of cell cycle progression and induction of cell apoptosis.

resveratrol; human pulmonary fibroblasts; proliferation；cell cycle；apoptosis；Cyclin D1

時間：2015-4-15 15:44 網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150415.1545.017.html

2015-01-07,

2015-02-05

湖南省教育廳重點資助項目(No 10A107)；湖南省教育廳優秀青年資助項目(No 14B142)

劉理靜(1976-)，男，碩士生，副主任醫師，研究方向：肺纖維化的防治，E-mail：wsfyz-000@163.com； 張 平(1954-)，男，教授，主任醫師，碩士生導師，研究方向：肺纖維化的防治，通訊作者，Tel:0734-8281948，E-mail:zp9707@sohu.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.05.017

A

1001-1978(2015)05-0673-07

R284.1；R329.24；R329.25；R563.130.22