雙側嗅球切除對小鼠行為、海馬神經遞質及抑郁相關基因表達的影響

王婷婷，黃 菲，吳 輝，張蓓蓓，張信誠，吳曉俊，胡之璧

(上海市復方中藥重點實驗室暨上海中醫藥大學中藥研究所，上海 201203)

雙側嗅球切除對小鼠行為、海馬神經遞質及抑郁相關基因表達的影響

王婷婷，黃 菲，吳 輝，張蓓蓓，張信誠，吳曉俊，胡之璧

(上海市復方中藥重點實驗室暨上海中醫藥大學中藥研究所，上海 201203)

目的 研究雙側嗅球切除對C57BL/6小鼠行為和海馬神經遞質及抑郁相關基因表達的影響。方法 用探針搗毀并用負壓吸出小鼠嗅球建立嗅球切除模型，術后18 d開始分別進行強迫游泳、懸尾、曠場、高架迷宮行為學測試，同時應用LC-MS/MS液質聯用法檢測海馬內7種神經遞質的變化，實時定量PCR法檢測海馬抑郁相關基因的表達。結果 嗅球切除后小鼠在曠場中的水平運動明顯增加(P<0.05)，進入高架迷宮開臂的時間明顯延長(P<0.01)，海馬組織中的5-HIAA/5-HT明顯降低(P<0.01)，Glu/GABA明顯增高(P<0.01)。同時海馬組織中的BDNF、Trkb、GDNF、CD11b、TNF-α基因表達明顯升高(P<0.05)，而TPH2基因表達下調(P<0.05)。結論 嗅球切除導致小鼠多種行為學改變，是多種神經傳遞以及神經營養因子、炎癥因子和合成蛋白基因綜合作用的結果，提示將該模型作為抗抑郁藥物的研發及篩選工具時需要綜合考慮多方面因素的影響，從而對實驗結果作出科學合理解釋。

抑郁；嗅球；神經遞質；海馬；神經營養因子；炎癥因子；抗抑郁藥

隨著生活節奏的加快，社會壓力的增加，抑郁癥的發病率逐年升高，嚴重危害著人類的身心健康。抗抑郁藥物的研發及篩選對于臨床抑郁癥的治療有及其重要的意義，而穩定可靠的抑郁動物模型對抗抑郁藥物的研發及篩選有非常重要的價值。嗅球切除是一種常用的抑郁研究模型，通過手術摘除或者破壞嗅球，直接導致動物嗅覺喪失和多個腦區神經元的退化。目前對于嗅球切除抑郁動物模型已有一定的研究，包括嗅球切除后動物的多種行為，如活動增強，被動逃避能力下降，學習記憶能力衰減，應激反應增強，同時進食和性行為發生改變等，這些癥狀與激越性抑郁癥相類似[1]。從這些行為改變中恢復正常需要長期服用抗抑郁類藥物，這與臨床抗抑郁治療的時程相似。盡管嗅球切除模型已經廣為應用，并且對術后動物海馬、前額葉、中腦、腦干等多個腦區神經遞質及相關蛋白表達影響也有研究報道[2-4]，但研究并不全面和系統，且很多報道結果不一，甚至存在相反的結論。本實驗系統研究了嗅球切除對動物海馬多種神經遞質，包括5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)、5-羥吲哚乙酸(5-hydroxyindoleacetic acid, 5-HIAA)、去甲腎上腺素(noradrenaline, NE)、多巴胺(dopamine, DA)、腎上腺素(epinephrine, Epi)、谷氨酸(glutamate, Glu)和γ氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)等，以及相關受體、轉運蛋白、神經再生和炎癥相關蛋白基因表達的影響，同時研究了嗅球切除對C57BL/6小鼠抑郁及焦慮行為的作用，為該模型更好地應用于科研和抗抑郁藥物的研發提供了參考。

1 材料

1.1 藥品與試劑異氟烷購自河北九派制藥股份有限公司(批號：130601)，注射用青霉素鈉購自華北制藥股份有限公司(批號：H13020657)，戊巴比妥鈉(批號：WS20120912)，色譜甲酸、色譜甲醇、乙腈購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.2 實驗動物♂5周齡C57BL/6小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，并在上海中醫醫藥大學動物實驗中心(25±1)℃，40%～60%相對濕度，晝夜各12 h SPF動物房自由進食飼養，實驗動物使用許可證號：SCXK(滬)2012-002

1.3 儀器液相質譜聯用儀購自安捷倫(型號DEBAF01206)，高架迷宮、曠場、懸尾及強迫游泳測試儀購自上海玉研，RMA-13-SSV小鼠麻醉機購自Medical Supplies & Services Int Ltd，高通量研磨儀由上海凈信科技提供(批號TL48E)，C18色譜柱(2.1×100 mm, 1.7 μm)購自Waters。

2 方法

2.1 動物分組及手術建模C57BL/6小鼠自購買后，適應性飼養1周，隨機分為假手術組(sham)和嗅球切除模型組(OB)，每組12只動物。異氟烷麻醉小鼠后，在兩耳連線中點處切開皮膚，暴露顱骨，電動磨鉆于嗅球處中線兩側將顱骨各鉆1個小孔，探針攪動破壞嗅球后，真空泵將破壞的嗅球組織吸出，吸收性明膠海綿填孔止血。假手術小鼠采用相同的手術方法，但在手術定位點上鉆孔后不損傷嗅球。青霉素溶液(20萬U·mL-1)沖洗手術切口，縫合皮膚，并肌注青霉素鈉每只4萬U，連續給藥3 d，以防術后感染。

2.2 行為學檢測小鼠手術后恢復18 d，分別進行如下行為學測定: ① 強迫游泳測試(FST),將小鼠置于預先注有20 cm深清水，溫度(25±1) ℃的圓柱型透明器皿內(高30 cm，直徑20 cm)，分別記錄每只小鼠在6 min內的累計不動時間，比較后4 min內的不動時間；② 懸尾測試(TST),用膠帶將小鼠尾部(距尾端2 cm)固定于一根水平木棍上，使動物呈倒掛狀態，其頭部離水平面5～6 cm，分別記錄每只動物在6 min內后4 min的累計不動時間；③ 曠場測試(OFT),將小鼠放入開場試驗箱正中間，軟件記錄5 min內小鼠總活動路程；④ 高架迷宮測試(EPMT) 將高架迷宮放在光線均勻的實驗區域內，分別將小鼠放入迷宮中央部位，實驗室開始時使頭部面向開臂，記錄5 min內小鼠進入開臂的時間和次數。

2.3 標本采集完成所有的行為學測試后，1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，于冰上分離小鼠腦組織，取出海馬后置EP管中，迅速放入液氮冷凍，并隨后保存在-80℃冰箱備用。

2.4 神經遞質檢測海馬組織稱重后，每份加入700 μL的甲酸-甲醇(1 ∶1 000) 和10 μL (10 μg·L-1，3, 4-dihydroxybenzylamine)內標，勻漿，23 000 r·min-1離心15 min(4℃)。取上清，氮氣吹干，每份再加100 μL流動相溶解，23 000 r·min-1離心15 min(4℃)后，取上清用于進一步分析。 LC-MS/MS色譜條件參考本實驗室已發表文獻[5]，液相條件如下：以甲酸-水(1 ∶1 000，A相)，乙腈(B相)為流動相進行梯度洗脫，0～4 min， 0.02 B；6 min， 0.8 B；8～10 min， 0.9 B；流速為0.1 mL·min-1。

2.5 實時定量PCR分析取海馬組織，TRIzol法提取總RNA，經DNaseI處理去除DNA污染后，試劑盒(Revert Aid First Strand Synthesis kit, Fermentas)反轉錄為cDNA，按照Taqman SYBR kit (Life Technologies)試劑盒說明方法進行實時定量PCR。PCR使用引物序列參見Tab 1，樣品的基因表達均以各自的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內參。

Tab 1 Primer sequences for realtime PCR

3 結果

3.1 嗅球切除對小鼠行為的影響如Fig 1A所示，切除嗅球之后，和假手術小鼠對比，模型組小鼠活動量明顯增加，在曠場中的水平運動距離明顯延長，差異有顯著性(P<0.05)。與此相對應，在高架迷宮中(Fig 1B)，模型組小鼠進入開臂時間長于空白組，差異有顯著性(P<0.01)。但在強迫游泳和懸尾測試中(Fig 1C、1D)，模型組小鼠的游泳不動時間與對照組比較，有上升的趨勢，但差異無統計學意義。

3.2 嗅球切除對海馬神經遞質的影響如Tab 2所示，嗅球切除改變了小鼠海馬神經遞質表達。結果顯示，模型組小鼠海馬5-HT含量明顯上升，和假手術組比較差異具有顯著性(P<0.01)。而5-HIAA含量在模型組中則明顯下降(P<0.05)。與此相對應，5-HIAA與5-HT含量的比值也明顯降低，差異有顯著性(P<0.01)。盡管DA、Epi、NE及GABA的含量在嗅球切除組小鼠的海馬中沒有變化，但Glu含量明顯升高(P<0.05)，而Glu與GABA的比值也有明顯上升(P<0.01)。

Fig 1 Effect of olfactory bulbectomy on mouse ±s,n=12)

A: Total distance in open-field test (OFT); B: Time spent in open arm of elevated plus maze test (EPMT); C: Immobility time in forced swimming test (FST); D: Immobility time in tail-suspension test (TST).*P<0.05,**P<0.01vsSham

Tab 2 Contents of neurotransmitters in hippocampus of olfactory bulbectomized mice ±s,n=12)

*P<0.05,**P<0.01vsSham

3.3 嗅球切除對海馬基因表達的影響基于海馬神經遞質LC-MS/MS檢測結果，我們進一步對5-HT、GABA以及Glu代謝、受體相關基因表達進行分析，同時對神經營養因子和炎癥相關基因也做了檢測。結果如Tab 3所示，嗅球切除影響了海馬中多種基因的表達，TPH2 mRNA表達下調(P<0.05)，BDNF/Trkb mRNA表達上調(P<0.05)，TNF-α/CD11b mRNA表達上調(P<0.05)，而其它基因則無顯著變化。

Tab 3 mRNA expression of proteins related to depression in hippocampus of olfactory bulbectomized ±s,n=5)

*P<0.05vsSham

4 討論

可靠穩定的抑郁動物模型對于抑郁癥發病機制、抗抑郁藥物的篩選及其抗抑郁作用機制研究有重要的意義。目前常用的抑郁動物模型有慢性輕度不可預見性應激模型、嗅球切除模型、行為絕望模型、習得性無助模型和一些藥物誘導模型如：糖皮質激素誘導、LPS誘導、利血平逆轉、5-羥色胺酸誘導大小鼠甩頭模型等[6-10]。另外，轉基因抑郁動物模型作為新型抑郁模型也得到了廣泛的應用[11-12]。然而，諸多模型都不能完全模擬臨床抑郁病人的癥狀，只能針對部分病癥研究，所以在現有研究基礎上應考慮運用多種模型結合來揚長避短。

嗅球切除抑郁模型是常用模型之一，有研究報道，嗅球切除后，小鼠表現為曠場試驗活動量增加，高架迷宮測試進入開臂時間增加[1]，本實驗研究結果與文獻報道一致。然而，在強迫游泳和懸尾測試實驗中，有研究結果表明嗅球切除后小鼠不動時間增加[13]，與典型的抑郁模型結果一致，而有些研究結果卻得出相反的結果，顯示小鼠嗅球切除后游泳不動時間反而減少[2]，本實驗采用6周齡成年C57BL/6♂小鼠，手術18 d后行為學測試，盡量減少手術創傷對小鼠行為學的影響。結果顯示，模型組較假手術組強迫游泳和懸尾不動時間均有一定程度的增加，但并沒有顯著性差異。分析其結果不一致的原因，可能與手術時小鼠是否成年、手術恢復后至行為學測試的時間長短、小鼠樣本數以及各實驗室具體的飼養和測試條件有關。

抑郁癥與腦內神經遞質5-HT及其代謝產物5-HIAA的含量密切相關。研究表明小鼠嗅球切除后5-HIAA/5-HT下降[14]，表明5-HT的代謝功能下降。本實驗對海馬神經遞質檢測，結果為嗅球切除組小鼠海馬內5-HT含量升高，5-HIAA/5-HT明顯降低，海馬內5-HT合成限速酶TPH2基因表達降低，則表明在5-HT合成降低的基礎上5-HIAA與5-HT的比值也降低，可能是由于5-HT的代謝和轉運功能降低，進而造成反饋抑制，影響了TPH2的基因表達。正常生理狀態下，神經細胞間隙存在的興奮性氨基酸與抑制性氨基酸維持平衡，當兩者之間平衡失調，則會產生情緒紊亂如抑郁、焦慮[15]。本實驗嗅球切除模型組小鼠海馬內興奮性氨基酸Glu與抑制性氨基酸GABA比值增高，表明細胞膜外堆積大量的興奮性氨基酸，作用于膜受體后導致一系列變化，最終引起神經元的損傷，從而導致小鼠抑郁焦慮樣表現。

TrkB為腦源性神經營養因子BDNF較高親和力的受體，BDNF通過激活受體TrkB，對神經元的生存及活動起重要調節作用[16]。文獻對嗅球切除后動物腦內BDNF變化的報道存在不一致，如Hellweg等[14]對嗅球切除16 d后小鼠海馬及額前葉內BDNF檢測結果顯示其表達增高等，而Hendriksen 等[17]研究在SD大鼠嗅球切除10周后檢測到海馬內BDNF mRNA水平明顯降低。也有實驗對嗅球切除15 d后和20 d大鼠海馬BDNF檢測，發現其沒有改變[18-19]。本文對海馬內BDNF mRNA及其受體TrkB mRNA的表達進行檢測，發現二者表達同樣升高，并且伴隨著膠質細胞源性的神經營養因子GDNF的增高，但并沒有伴隨腦源性神經生長因子NGF的表達上調。對于嗅球切除后海馬內BDNF結果報道不一致及本實驗結果分析，其原因可能為種屬的不同，在小鼠中，嗅球切除后會有一段適應性反應，在此時間段內，小鼠海馬神經元反饋性調節腦源性神經營養因子，使其表達上調，有助于神經損傷的修復。

大量研究表明，抑郁癥與炎癥密切相關，抑郁癥患者存在免疫功能激活[20]。TNF-α屬于前炎癥細胞因子，是一系列炎癥反應中最早產生的細胞因子，臨床研究表明抑郁患者腦內TNF-α處于激活狀態[21]。CD11b是白細胞黏附分子β2整合素的a亞單位，與白細胞和內皮細胞的黏附有關，正常情況下，CD11b在中性粒細胞表面低水平表達，貯存在細胞的胞質顆粒中，在一系列前炎癥調節因子，如LPS、TNF-α、IL-1β等刺激下，迅速易位至細胞膜，在細胞表面大量表達[22]。本實驗發現小鼠海馬內TNF-α和CD11b mRNA表達上調，則表明嗅球切除后小鼠免疫力下降導致炎癥相關因子表達上調。

綜上所述，本實驗發現嗅球切除不僅影響了動物的行為，還影響了海馬內多種神經遞質及其相關代謝產物、神經營養因子、炎癥相關基因的表達，提示抗抑郁藥物的篩選及機制研究需綜合應用多種動物模型并考慮多種因素影響，從而得出科學合理的結論。

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Influence of olfactory bulbectomy on mouse neurobehaviors, hippocampal neurotransmission and depression relevant gene expressions

WANG Ting-ting, HUANG Fei, WU Hui, ZHANG Bei-bei, ZHANG Xin-cheng, WU Xiao-jun, HU Zhi-bi

(ShanghaiKeyLaboratoryofComplexPrescriptions,InstituteofChineseMateriaMedica,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China)

Aim To investigate the changes of behaviors, neurotransmitters and depression related gene expressions in hippocampus of C57BL/6 mice after olfactory bulbectomy (OB). Methods Forced swimming test (FST), tail suspension test (TST), open filed test (OFT), and elevated plus maze test (EPMT) were used to evaluate the behavioral changes 18 days after surgery. LC-MS/MS method was employed to measure the hippocampal neurotransmitters. Quantitative PCR approach was established to determine the hippocampal gene expressions associated with depression. Results OB mice were hyperactive in OFT (P<0.05) accompanied with increased time spent in open arm of EPMT (P<0.01). Meanwhile, the sur-gery led to the reduction of the ratio of 5-HIAA/5-HT (P<0.01) but the increase of Glu/GABA (P<0.01) in hippocampus. Moreover, OB elevated the gene expressions of BDNF, Trkb, GDNF, CD11b and TNF-α but down-regulated that of TPH2 in hippocampus (P<0.05). Conclusion Behavioral alternation of OB mice was a result of comprehensive effect of the changes of neurotransmission and depression related genes, which call us special attention in using OB as an animal model for research and development of antidepressants.

depression; olfactory bulb; neurotransmitter; hippocampus; neurotrophic factor; inflammatory factor; antidepressant

時間：2015-4-15 15:44 網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150415.1545.019.html

2014-12-31,

2015-01-23

教育部高等學校博士學科點專項科研基金優先發展領域項目(No 20123107130002);上海市教委科研創新重點項目(No 13ZZ099);上海高校特聘教授(東方學者)崗位計劃資助(No 2013-59)

王婷婷(1988-)，女，碩士生，研究方向：中藥神經藥理學，E-mail：13816792603@163.com; 吳曉俊(1976-)，男，博士，研究員，研究方向：中藥神經藥理學，Tel：021-51322578，E-mail：xiaojunwu@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.05.019

A

1001-1978(2015)05-0686-06

R-332；R322.81；R394.2；R338.1；R749.42； R971.43