PPARγ介導卡托普利改善高糖誘導血管內皮細胞胰島素抵抗的作用

嚴國強，陳春香，陳芳輝，高 艷，儲佳佳，李 騰，黃起壬

(1.江西省基礎藥理學重點實驗室，2.南昌大學藥學院藥理學教研室，江西 南昌 330006)

PPARγ介導卡托普利改善高糖誘導血管內皮細胞胰島素抵抗的作用

嚴國強1,2，陳春香1,2，陳芳輝1,2，高 艷1,2，儲佳佳1,2，李 騰1,2，黃起壬1,2

(1.江西省基礎藥理學重點實驗室，2.南昌大學藥學院藥理學教研室，江西 南昌 330006)

目的 研究卡托普利(captopril，Cap)對高糖(high glucose，HG，33 mmol·L-1)誘導的人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelium cells，HUVECs)胰島素抵抗(insulin resistance，IR)的作用及機制。方法 首先觀察Cap對HG(33 mmol·L-1)誘導的HUVECs IR的改善作用。實驗隨機分為5組，即正常對照(Control)組、IR組、IR+CapⅠ(1×10-6mol·L-1)組、IR+CapⅡ(1×10-5mol·L-1)組、IR+CapⅢ(1×10-4mol·L-1)組。其次證實Cap改善HG(33 mmol·L-1)誘導HUVECs IR的作用是由PPARγ介導。實驗隨機分為6組，即Control組、IR組、IR+Cap(1×10-5mol·L-1)組、PPARγ抑制劑GW9662(PI，1.0 μmol·L-1)組、IR+PPARγ抑制劑(IR+PI，1.0 μmol·L-1)組、IR+Cap+PPARγ抑制劑(IR+Cap+PI，1.0 μmol·L-1)組，除Control組和PI組外，所有各組先用含33 mmol·L-1葡萄糖的DMEM培養48 h，Cap各組再加不同濃度的Cap處理4 h，最后胰島素(100 nmol·L-1)處理30 min，抑制劑組再加抑制劑(1.0 μmol·L-1)處理1 h，最后進行指標檢測。結果 IR組NO水平明顯降低、ET-1含量明顯升高，提示細胞已產生IR，但PPARγ mRNA和蛋白表達水平與Control組相比差異無統計學意義(P>0.05)；Cap呈濃度依賴性逆轉HG誘導NO和ET-1水平的改變，明顯增加磷酸化PPARγ(P-PPARγ)水平，說明其可明顯改善HG誘導的IR，但對PPARγ mRNA和蛋白表達水平無明顯影響(vsIR，P>0.05)；加PI處理后，Cap改善IR的作用完全取消，提示Cap改善IR的作用是由PPARγ介導。結論 Cap可通過PPARγ介導改善高糖所致血管內皮細胞IR，其機制可能與PPARγ表達水平無關，而與PPARγ激活有關。

卡托普利；高糖；人臍靜脈內皮細胞；胰島素抵抗；PPARγ；NO；ET-1

現代醫學研究表明，血管內皮胰島素抵抗是糖尿病發生血管并發癥的始動環節，是滋生多種代謝相關疾病的共同“土壤”[1-2]。但目前，國內外對其發病機制尚不完全清楚。因此,闡明血管內皮IR發生的分子機制，發現糖尿病防治藥物新的分子作用靶點及開發新的防治藥物，對于降低糖尿病患者心腦血管事件發生，改善患者生存質量具有重要意義。PPARγ 是過氧化物增殖酶體激活受體超家族(PPARs) 的成員之一，是體內糖代謝和脂肪細胞分化的重要調節因子，是胰島素增敏劑噻唑烷二酮類的靶標[3]，能改善血管內皮細胞對胰島素的敏感性，機制可能與其激活了PPARγ依賴的胰島素信號轉導途徑有關。另外，PPARγ也能在配體依賴方式下通過抑制其他轉錄因子，如NF-κB及活化劑蛋白-1家族，從而直接地抑制促炎癥基因的表達[4-5]。研究證實前列腺素衍生物如15-脫氧前列腺素J2(15-d-PGJ2)是PPARγ的天然激動劑[6-7]。

卡托普利(captopril，Cap)是第一代的血管緊張素轉化酶抑制劑，臨床廣泛用于合并了糖尿病的高血壓或心衰患者的治療。有研究證實，Cap可通過增加前列腺素衍生物、緩激肽(bradykinin, BK)水平來改善IR[8-9]，那么，它能不能通過直接改變PPARγ的表達或活性來改善IR，目前相關報道甚少，因此，本實驗探討卡托普利改善內皮細胞胰島素抵抗的機制，為尋找糖尿病血管病變防治的分子靶點拓展新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞株及血清培養基實驗用HUVECs株購自美國ATCC(Catalog No: CRL-1730)；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM培養基購自Gibco BRL公司。

1.2 藥品及試劑NO檢測試劑盒購自Beyotime Institute of Biotechnology；ET-1試劑盒購自上海RD生物公司；卡托普利購自上海普康公司；PPARγ抑制劑(GW9662)購自美國Sigma；PPARγ多克隆抗體購自美國Cell Signaling；PPARγ磷酸化抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology；β-actin多克隆抗體購自美國Santa Cruz；TRIzol 試劑購自Invitrogen公司；MMLV逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、dNTP、Oligo(dT)15、Taq酶均購自Promega Corporation；引物購自上海捷瑞生物公司；其它各種化學試劑為進口或國產分析純試劑。

1.3 實驗分組及處理方法

1.3.1 Cap對HG誘導的HUVECs IR的改善作用 將HUVECs均勻接種在六孔培養板上，隨機分為5組，即Control組、IR組、IR+CapⅠ(1×10-6mol·L-1)組、IR+CapⅡ(1×10-5mol·L-1)組、IR+ CapⅢ(1×10-4mol·L-1)組。除Control組(5.5 mmol·L-1葡萄糖的DMEM培養48 h)外，所有各組先用含33 mmol·L-1葡萄糖的DMEM培養48 h，Cap各組再加不同濃度的Cap處理4 h，最后胰島素(100 nmol·L-1)處理30 min，收集細胞上清液和細胞，分別進行指標檢測。

1.3.2 Cap改善HG誘導HUVECs IR的作用是由PPARγ介導 將HUVECs均勻接種在六孔培養板上，隨機分為6組，即Control組、IR組、IR+CapⅡ(1.0×10-5mol·L-1)組、PPARγ抑制劑GW9662(PI，1.0 μmol·L-1)組、IR+PPARγ抑制劑(IR+PI，1.0 μmol·L-1)組、IR+Cap(1.0×10-5mol·L-1)+ PPARγ抑制劑(IR+Cap+PI，1.0 μmol·L-1)組，除Control組和PI組(5.5 mmol·L-1葡萄糖的DMEM培養48 h)外，所有各組先用含33 mmol·L-1葡萄糖的DMEM培養48 h，Cap各組再加不同濃度的Cap處理4 h，最后胰島素(100 nmol·L-1)處理30 min，抑制劑組再加抑制劑GW9662(1.0 μmol·L-1)處理1 h，收集細胞上清液和細胞，分別進行以下指標檢測。

1.4 HUVECs中NO、ET-1水平的檢測(a) 參照碧云天生物技術研究所一氧化氮檢測試劑盒的使用說明，先做出標準曲線，然后根據各組吸光度，計算出各組NO的含量。(b) 參照人內皮素(ET)酶聯免疫試劑盒的使用說明，先做出標準曲線，然后根據各組吸光度，計算出各組ET-1的含量。

1.5 Western blot檢測HUVECs內PPARγ、P-PPARγ蛋白的表達細胞經實驗因素處理后，經PBS清洗后，用RIPA裂解液進行裂解，蛋白濃度用BCA試劑盒進行測定，細胞裂解物溶于上樣緩沖溶液煮沸后經10%的SDS-PAGE電泳分離，并電轉到PVDF膜上，取出后將膜放入質量濃度均為50 g·L-1的脫脂牛奶或者BSA中封閉2 h，再用TBST洗膜3次，每次15 min。將膜放入一抗中(1 ∶750)，4℃孵育過夜。TBST沖洗膜后，將膜放入相應的二抗(1 ∶2 000)中，室溫平搖2 h后，漂洗3次，每次20 min，用ECL化學發光法進行檢測。將曝光條帶進行X光膠片掃描后，在醫學圖形分析系統ImageTool軟件上進行分析，將所得PPARγ蛋白帶的綜合密度分別除以對應組β-actin的綜合密度后，Excel表中進行分析。

1.6 HUVECs PPARγ mRNA表達檢測PCR擴增所用引物由上海生物工程有限公司合成，PPARγ上游引物：5′-TCTGGCCACCAACTTTGGG-3′；下游引物：5′-CTTCACAAGCATGAACTCCA-3′，PCR擴增片段長度為360 bp。內參β-actin上游引物：5′-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3′；下游引物：5′-TGGAAGGTGG ACAGCGAGG-3′ ，PCR擴增片段長度為268 bp。PCR擴增體系為25 μL，其中cDNA為5 μL，上、下游引物各1.0 μL，2X Tag酶為12.5 μL，再用無菌三蒸水補至25.0 μL。PCR循環參數為30，94℃預變性5 min，94℃變性45 s，擴增PPARγ為61℃退火30 s，擴增β-actin 為55℃退火45 s，72℃延伸45 s，最后72℃延伸5 min。取擴增產物6 μL上樣，1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，在透射紫外光分析儀下攝影，并在電腦上用Image Tool圖像處理軟件進行處理。

2 結果

2.1 Cap呈濃度依賴性改善HG誘導HUVECs胰島素抵抗血管內皮IR評價指標常用血清或培養上清液中NO 和ET-1水平來表示。IR組與Control組比較，NO水平明顯降低、ET-1水平明顯升高(P<0.01vsControl)；用低劑量的卡托普利處理4 h后，與IR相比NO水平明顯升高且差異有顯著性(P<0.05vsIR)，而ET-1水平與IR組比較組間差異沒有統計學意義(P>0.05)；中、高劑量的卡托普利處理后，NO升高更明顯(P<0.01vsIR)，ET-1水平明顯降低(P<0.05)，見Fig 1。

2.2 Cap改善HG誘導HUVECs胰島素抵抗是由PPARγ介導見Fig 2。PI組與Control組比較，NO、ET-1水平無明顯差異(P>0.05)；IR+PI組與IR組比較，NO、ET-1水平差異也無統計學意義(P>0.05)；IR+Cap組與IR組相比NO水平明顯升高、ET-1水平明顯下降(P<0.01)；而IR+Cap+PI組與IR+Cap組相比NO水平明顯下降、ET-1水平明顯升高(P<0.01)。

Fig 1 NO,ET-1 levels of various treatments in cultured ±s,n=6)

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsIR group

Fig 2 NO,ET-1 levels of various treatments in cultured HUVECs ±s,n=6)

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsIR group;△△P<0.01vsIR+Cap group

2.3 Cap對HUVECs胰島素抵抗 時PPARγ mRNA表達的影響PPARγ mRNA各組樣本均由對應的β-actin條帶的掃描值標化再與Control組比較。PPARγ mRNA在正常HUVECs中呈基礎性表達；HUVECs暴露在高糖培養液中48 h后，PPARγ mRNA的表達與Control組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。Cap組中內皮細胞的PPARγ mRNA的表達量與IR組相比組間無明顯差異(P>0.05)，見Fig 3。

2.4 Cap對HUVECs胰島素抵抗時PPARγ和P-PPARγ蛋白表達的影響PPARγ各組樣本均由對應的β-actin條帶的掃描值標化。PPARγ蛋白、P-PPARγ蛋白在正常HUVECs中呈基礎性表達。IR組中PPARγ蛋白、P-PPARγ蛋白表達量無明顯變化，與 Control組相比，差異無統計學意義(P>0.05)；Cap組中內皮細胞的PPARγ 蛋白的表達量與IR組相比亦無明顯差異(P>0.05)；而低、中劑量Cap組中內皮細胞的P-PPARγ 蛋白的表達量較IR明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；而高劑量Cap組與IR組相比P-PPARγ蛋白的表達無明顯差異(P>0.05)，見Fig 4。

3 討論

卡托普利可以改善胰島素抵抗，已有大量的資料證實。可能的作用機制目前有以下幾個方面：通過擴血管效應，增加骨骼肌的血流，可促使葡萄糖和胰島素向胰島素敏感組織釋放， 增加葡萄糖的利用；通過改善胰腺的血液循環從而提高胰島β細胞的代謝，促進胰島素分泌，加強靶細胞功能，提高胰島素的生物效應，改善胰島素抵抗[10-11]；Captopril還能通過抑制血管緊張素轉換酶活性，使組織內BK降解減少，局部血管BK濃度增高，BK具有擴張血管和降壓作用，BK是血管內皮L-精氨酸-NO途徑的重要激活劑，它作用于內皮的β2受體能引起血管內皮超極化因子及NO的釋放，BK降解減少還能進一步促進15-d-PGJ2合成，而15-d-PGJ2是PPARγ的天然激動劑。

Fig 3 Effect of various treatments on expression levels of

The left panel shows a representative electrophoretic diagram for PPARγ, β-actin mRNA by agrose gels; the right panel shows a statistical diagram of grey density

在我們的前期工作中，從整體動物、細胞和分子水平觀察了PPARγ經典配體如羅格列酮(RG)或匹格列酮(PG)對高糖誘導血管內皮胰島素抵抗的作用，探討了其可能的作用機制。結果表明，無論RG或PG預處理和后處理，PG和RG均能明顯改善HG誘導HUVEC胰島素抵抗，其機制是通過非經典PPARγ依賴的NF-κB轉錄抑制途徑(under revision)。PPARγ表達很廣泛，包括脂肪細胞、內皮細胞、血管平滑肌細胞、巨噬細胞和心肌細胞等[12]。

本實驗中，卡托普利改善胰島素抵抗是否通過PPARγ來介導的目前機制還并不清楚。實驗中用高糖(33 mmol·L-1)處理內皮細胞48 h后再用胰島素處理0.5 h，取其細胞上清測NO和ET-1水平，發現其NO水平比正常組明顯下降，且差異具有統計學意義；ET-1水平明顯升高，且差異具有統計學意義。證明胰島素抵抗的模型建立成功。胰島素抵抗模型建立后，在預實驗中，我們設計了卡托普利濃度梯度(10-8～10-2mol·L-1)，結果發現，濃度≤10-7mol·L-1時，Cap對細胞活力和胰島素抵抗程度均沒有影響；而濃度≥10-3mol·L-1時，細胞活力明顯下降，表現出明顯地細胞毒性。因此，我們就選擇了1.0×10-5mol·L-1的濃度。用Cap處理4 h后，其NO水平比IR組明顯升高，ET-1水平比IR組明顯降低，PPARγ蛋白表達水平與IR組相比無明顯改變，但P-PPARγ蛋白表達水平比IR組升高。結合文獻資料可能存在機制：在高糖和胰島素的刺激下，內皮細胞受損，導致NO的分泌減少，ET-1的分泌增多，而這兩類物質動態平衡維持著血管的正常狀態和功能。用Cap處理4 h后，Cap可以使內皮細胞內BK的減少，進而促進15-d-PGJ2的生成，15-d-PGJ2是PPARγ的天然激動劑，可以使PPARγ磷酸化途徑被激活，進而改善胰島素抵抗。

Fig 4 Effect of various treatments on expression levels of PPARγ and P-PPARγ in cultured HUVECs ±s,n=6)

The upper panel shows representative Western blot for PPARγ, P-PPARγ and β-actin; the lower panel shows a statistical diagram of grey density.#P<0.05vsIR group.

綜上所述，卡托普利可以促使P-PPARγ蛋白的表達上調，PPARγ與胰島素信號之間亦存在著正反饋機制；PPARγ可通過轉錄激活作用增加靶基因的表達或激活來發揮作用。活化的PPARγ能抑制脂肪細胞表達腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，減輕TNF-α誘發的胰島素抵抗，且通過增加c-CBL相關蛋白及胰島素受體底物2的表達，增強胰島素的信號轉導，從而改善胰島素抵抗。

[1] Ford E S. Risks for all-cause mortality, cardiovascular disease and diabetes associated with the metabolic syndrome: a summary of the evidence [J].DiabetesCare, 2005, 28(7): 1769-78.

[2] Marina C, Maria A M, Simona F,et al. Carotid artery intima-media thickness is associated with Insulin-mediated glucose disposal in nondiabetic normotensive offspring of type 2 diabetic patients [J].AmJPhysiolEndocrinolMetab, 2007, 292(1): E347-52.

[3] 張 寧,孟愛民,王莉莉.選擇性PPARγ調節劑治療二型糖尿病的分子機制研究進展[J].中國藥理學通報,2013, 29(2):157-60.

[3] Zhang N, Meng A M, Wang L L. Molecular mechanism of selective PPARγ modulators for type 2 diabetes treatment[J].ChinPharmacolBull, 2013, 29(2):157-60.

[4] Veliceasa D, Schulze-Hoepfne Ft, Volpertl O V. PPARγ and agonists against cancer: rational design of complementation treatments [J].PPARRes，2008, 2008：945275.

[5] Patel N G, Holder J C, Smith S A. Differential regulation of lipogenesis and leptin production by independent signaling pathways and rosiglitazone during human adipocyte differentiation [J].Diabetes, 2003, 52(1):43-50.

[6] Scheen A J. Renin-angiotensin system inhibition prevents type 2 diabetes mellitus part1, a meta-analysis of randomized clinical trials [J].DiabetesMetab, 2004, 30(6): 487-96.

[7] Haseqawa H, Takano H, Komurol. Therapeutic implications of PPARgamma in cardiovascular diseases [J].PPARRes, 2010, 2010：876049.

[8] Sharma J N, Kesavarao U. The effects of captopril on cardiac regression, blood pressure and bradykinin components in diabetic Wistar Kyoto rats[J].ImmunopatholPharmacol, 2011, 24(2): 337-43.

[9] Adam A, Leclair P, Montpas N, Koumbadinga G A. Altered cardiac bradykinin metabolism in experimental diabetes caused by the variations of angiotensin-converting enzyme and other peptidase [J].Neurpeptides, 2010, 44(2): 69-75.

[10] Hermann T S, Li W, Dominguez H, et al. Quinapril treatment increases insulin-stimulated endothelial function and adiponectin gene expression in patients with type 2 diabetes [J].ClinEndocrinolMetab, 2006, 91(3): 1001-8.

[11] Leung P S, Carlsson P O. Tissue renin-angiotensin system:its expression,localization, regulation and potential role in the pancreas [J].MolEndocrinol, 2001, 26(3): 155-64.

[12] Videla L A, Pettinelli P. Misregulation of PPAR functioning and its pathogenic consequences associated with nonalcoholic fatty liver disease in human obesity [J].PPARRes, 2012, 2012：107434.

Improvement effect of captopril on insulin resistance mediated by PPARγ in vascular endothelial cells

YAN Guo-qiang1,2, CHUN Chun-xiang1,2, CHEN Fang-hui1,2,GAO Yan1,2, CHU Jia-jia1,2, LI Teng1,2, HUANG Qi-ren1,2

(1.TheKeyLaboratoryofBasicPharmacologyinJiangxiProvince; 2.DeptofPharmacology,CollegeofPharmacy,NanchangUniversity,Nanchang330006,China)

Aim To investigate the role of captopril in insulin resistance of endothelial cells induced by high glucose. Methods 1. Improvement effect of captopril on insulin resistance in HUVECs was observed. The HUVECs were seeded in a 6-well plate and were randomly divided into 5 groups, namely, control group, IR group, IR together with different Cap concentrations (low, medium and high concentration), respectively. 2. Improvement effect of Cap on insulin resistance was mediated by PPARγ in HUVECs. HUVECs were randomly divided into 6 groups, namely, control group, control+PPARγ inhibitor (PI)(1.0 μmol·L-1)group, IR group, IR+PI(1.0 μmol·L-1)group, IR+Cap( 1×10-5mol·L-1) group, and IR+Cap+PI (1.0 μmol·L-1)group. All indicators were detected. Results After HUVECs were incubated with media containing 33 mmol·L-1of glucose for 48 h, the NO levels were significantly decreased while ET-1 levels were significantly elevated, showing a significant difference between IR group and control group (P<0.01). The expression levels of PPARγ mRNA and its protein were somewhat up-regulated, but there was no significant difference between IR group and control group (P>0.05). When the HUVECs in IR group were treated with DMEM containing glucose (33 mmol·L-1) for 48 h and insulin for 30 min, the expression levels of PPARγ mRNA and its protein in Cap groups were similar to those in the IR group, and there was no significant difference between the two groups (P>0.05); however, the expression levels of phosphorylated-PPARγ protein in Cap groups were increased compared with IR group (P<0.05). The levels of NO were significantly increased whereas the levels of ET-1 were decreased in Cap groups, which had significant differences compared with IR group (P<0.05). Nonetheless, pre-treating with GW9662, a PPARγ inhibitor, the improvement effects of Cap were markedly abolished. Conclusions Captopril could improve high glucose-induced insulin resistance of endothelial cells mediated by PPARγ, and the underlying mechanisms are related to the activation of PPARγ, rather than its expression.

captopril; high glucose; human umbilical vein endothelium cells; insulin resistance; PPARγ; NO; ET-1

時間：2015-3-16 15:41 網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150316.1541.027.html

2014-10-31,

2014-12-04

國家自然科學基金資助項目(No 81360060、81070633、30860111、30660058)；江西省主要學科學術和技術帶頭人培養計劃項目(No 20123BCB22005)

嚴國強(1989-)，男，碩士生，研究方向：內分泌代謝性疾病藥理學,E-mail:ygq19890926@126.com 黃起壬(1967-)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：內分泌代謝性疾病藥理學,通訊作者, E-mail:qrhuang@ncu.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.04.019

A

1001-1978(2015)04-0532-06

R322.12；R458.5；R543.02；R587.1；R972.4；R977.6