油菜素內酯及其在種子萌發過程中的生理效應研究進展

朱早兵等

摘 要 簡述油菜素內酯的化學結構、合成、信號傳導機制，種子萌發生理，正常環境下油菜素內酯促進種子萌發的生理作用和逆境條件下油菜素內酯對種子萌發的促進效應等，提出油菜素內酯促進種子萌發機理的研究方向。

關鍵詞 油菜素內酯 ；種子萌發 ；進展

分類號 Q945

Abstract Based on the introduction of brassinolide sources， methods of synthesis and signal transduction pathway， the paper mainly expounded the physiological effects of brassinolide on seeds during germination stage and part of the molecular mechanism that brassinolide promoted seed germination when the seeds were in the normal and stress conditions， further put forward the research direction of the mechanism that brassinolide promoted seed germination.

Keywords brassinolide ； seed germination ； research progress

油菜素內酯（brassinolide， BL）又名蕓苔素內酯或蕓苔素，是植物中的甾醇類生長促進激素，它的作用貫穿植物萌發到開花結果的整個生活史，它能促進細胞伸長，影響細胞分裂分化，促進植物進入生殖生長，影響花誘導及分化，同時在提高植物對逆境條件抵御能力，增強植物凈光合作用、增加作物產量等方面都具有十分重要的意義。由于油菜素內酯在提高作物耐旱、耐寒和耐鹽等方面的能力，以及提高作物抗病性的作用已超過現有的5種激素，被國際上譽為第六激素[1]。自發現以來，科研人員對油菜素內酯各方面的研究不斷取得突破性進展，尤其是近幾年在促進種子萌發、提高作物對外界不良環境的抗性機理和促進作物幼苗細胞伸長分裂，減少水果和蔬菜中農藥殘留等研究取得了很大進步，同時在果蔬、農林方面的應用情況也有報道[2]，這為今后油菜素內酯應用于生產實際提供了理論基礎。近年來，油菜素內酯在種子萌發階段的的生理效應研究逐步展開，包括種子萌發階段的信號傳導機制、下胚軸的伸長作用原理等。筆者簡述近年油菜素內酯在種子萌發階段的生理作用和促進萌發分子機理的研究成果，闡述了油菜素內酯促進種子萌發的生理效應，以期為深入研究油菜素內酯在種子萌發生理方面的作用機理提供參考。

1 油菜素內酯的化學結構、合成及信號傳導機制

1.1 油菜素內酯的化學結構

20世紀70年代，科學家對甘藍型油菜（Brassica napus）進行研究，從花粉中發現了一種物質，后對其進行大量的采集、分離、純化和結構分析，最終證明它具有與動物固醇類激素（雌性激素，睪酮等）相似的結構，并且多攜帶一定活性基團側鏈的一種化合物（如圖1），命名為油菜素內酯（brassinolide， BL）[3-4]，迄今發現約70種BL的類似物，它們合稱油菜素甾醇類物質（brassinosteroid， BR），BR與BL結構上的區別主要在A，B環的修飾基團不同，油菜素甾醇類激素根據B環官能團的不同分成3類，再根據甾醇延伸出的基團不同又可將其分為7類，BL是BR中活性最強的分子，其它油菜甾醇類物質的活性只有BL的1/10[5-6]。科學家推測BR活性強主要原因是與BR母體甾醇中A和B環的反式結構、B環的6-O和6-O-7-氧雜環集團及A環的順式α向的羥基集團等結構因素有關[7]。

BR在植物體中廣泛存在，無論單子植物、雙子葉植物、裸子植物、被子植物或是低等植物、高等植物都含有BR，其中栗甾醇（CS）分布最為廣泛。不同組織、不同器官、甚至不同生長時期BR含量有很大差別，一般幼嫩的組織器官含量高于成熟的組織器官，幼年時期高于成熟期，生長旺盛部位合成也越多[8-9]。

1.2 BR的合成

20世紀70年代國外已有油菜素內酯合成研究。美國、日本等國研究人員分別以麥角甾醇和油菜甾醇作為原料合成油菜素內酯，但都由于反應步驟長、總收率低等因素無法實現工業化生產，中國從1988年開始有合成的研究[10]，主要是合成BRll、BR12、BR，合成途徑：

植物甾醇酯磺酸→甾酮→二羥基甾酮 →四羥基甾醇→油菜素甾醇類物質（最終產物），該反應具有原料易獲得、反應路線短、產物容易控制和反應收率高等優點。

隨著GC-MS和GC-MS-SIM技術發展，通過飼喂標記的方法，發現另一合成路徑：

甲基戊酸（類萜途徑起始分子）→鯊烯→油菜甾醇（campesterol， CR，反應的起始物質）→油菜甾烷醇（CN）→C-6早期氧化途徑或C-6晚期氧化途徑→油菜甾酮→油菜素內酯[11]，該過程中油菜甾醇經一系列加氧、羥化、脫羥等途徑最終合成油菜素內酯（圖2）。該合成途徑主要分為2條：前期C6氧化途徑和后期C6氧化途徑[12]。這2條途徑的劃分與甾醇體側鏈反應時C6酮基與C22、C23、C2及C3進行位置修飾的先后有關[13]。

1.3 BR的信號傳導機理

目前，對雙子葉植物擬南芥和單子葉植物水稻中BR信號傳導研究較為深入[14-15]。研究證明，植物甾醇類激素與動物甾醇有所不同，其信號傳遞主要通過結合細胞膜外層上的BR不敏感蛋白（brassinosteroid insensitive 1，BRI1）受體激酶后被感知，然后將信號傳遞到細胞質，在細胞質中BRI1與共受體BAK1（BRI1-associated receptor kinase，BAK）結合成二聚體，然后通過一系列的蛋白磷酸化和去磷酸化以及蛋白定位的改變，將信號傳遞給核中，通過轉錄因子直接調控下游基因的表達來實現對不同生理效應的調控[16]。在這一途徑中：若BR信號沒有被感知時，BRI1與自身共受體BAK1結合后將被負調控蛋白BRI1抑制[17]，同時類GSK3蛋白激酶BIN2磷酸化轉錄因子BZR1/BES1使之失活，無法進入細胞核識別DNA實現相應的生理調控[18]；當BR存在時，BR被信號受體BRI1感知后，與BRI1抑制子（BRI1 Kinase inhibitor 1， BKI1）發生解離[19]，被磷酸化解離的BRI1將很快與細胞質中BAK結合，BAK1-BRI1被激活后繼續磷酸化，BR信號激酶（brassinosteroid-signalling kinase， BSKs）和組成型差異生長蛋白1（constitutive differential growth1，CDG1）的下游激酶，繼而對下游的激酶BSU1去磷酸化作用，同時增強了BSU1的去磷酸化能力，對BIN2的活性產生抑制作用[20]，使之不能進一步磷酸化下游轉錄基因BESI或BZRI，最后轉錄因子在PP2A磷酸酶作用下去磷酸化，進入細胞核中實現基因調控[21]（圖3）。

2 BR在種子萌發過程中的生理效應

2.1 種子萌發生理

種子的萌發是植物生命開始，萌發的好壞直接影響植物后期的生長、發育及成熟。通常意義上的種子萌發是胚根和胚軸突破組織，在種子發芽的過程中主要有3個步驟：干燥的種子吸水后發生的吸脹作用；種子吸水之后的生理代謝被激活；胚軸、胚根突破組織完成萌發[22]。吸脹作用主要由植物種子的襯質勢引起，干種子的襯質勢大，死或活的干種子都存在著吸脹作用[23]，水透過種子細胞壁，進入細胞膜，干種子中原來以凝膠狀態的襯質物在水合作用下形成液晶狀，同時種子體積發生膨脹，將原有的膜質結構破壞，襯質溢出。種子在發生吸脹之后，細胞迅速分裂，各種代謝酶被激活，多種內源激素也快速合成，赤霉素含量迅速上升，種子吸水后ABA濃度降低，對種子萌發抑制作用減弱[24]，種子活性增強，胚根突破組織，胚軸不斷伸長完成萌發。

2.2 在適宜條件下，BR促進種子萌發的生理作用

2.2.1 BR對細胞伸長和分裂的調控

BR能夠促進細胞伸長，BR處理可以促進香蕉不定芽的發生，在玉米根系試驗中發現，BR能增強ATPase活性，導致H+-ATPase釋放H+酸化非質體從而改變細胞的可塑性，細胞壁松弛，促進生長[25]。BR對水稻細胞的伸長和分裂的調控研究方面，張海麗等[26]通過對水稻愈傷組織體積和細胞分布、懸浮系細胞形狀大小以及細胞骨架蛋白的分析研究發現，BR處理后，水稻細胞中有絲分裂基因CDC48（cell division cycle protein 48）及縮短細胞分裂周期基因CYCD2（cyclin D2）的代謝增強，且BR對水稻細胞伸長的調控作用中存在劑量效應，低濃度的BR能夠促進水稻細胞的伸長，高濃度抑制；利用蛋白質組學技術對F-actin細胞骨架進行水平分析，發現BR能夠促進細胞微絲骨架F-actin的積累，在F-actin的表達分析中發現，BR對F-actin微絲骨架形成存在誘導作用，這表明BR是通過調控細胞分裂相關基因表達和誘導細胞骨架形成來調控細胞分裂及伸長。

2.2.2 BR對種子α-淀粉酶活性的影響

種子吸水后，生理代謝增強，同時需要大量的能量，這些能量來源于糖的分解代謝，淀粉作為種子中重要的能量儲存物質，在種子萌發時的分解轉化至關重要，一些谷物的干種子中不含有α-淀粉酶，α-淀粉酶在種子萌發時合成，紀秀娥等[27]研究發現BR處理能明顯增強α-淀粉酶的活性，隨濃度上升促進作用下降。

2.2.3 BR與其他激素協同作用提高種子的發芽勢及發芽率

種子萌發過程受多種激素調節，激素通過作用于相應的靶細胞受體，對細胞生長發育起到調控作用，種子萌發過程中脫落酸（ABA）主要誘導種子進入休眠；赤霉素（GA）主要是解除休眠；GA在萌發的種子胚內合成、釋放及轉運等途徑到達糊粉層，促進糊粉層中不溶性糖及蛋白質轉化為可溶性糖和氨基酸，為胚的發育提供營養物質，促進種子萌發[28]；BRs與其他植物激素誘導種子萌發的機制有所不同。近年研究發現，BR存在一條蛋白質磷酸化調控途徑，該途徑通過調節BR受體感知與BR受體抑制子的激活，轉錄因子的激活以及BR受體激酶和蛋白質激酶活性的一系列反應途徑，通過轉錄因子BESI等進入細胞核來實現基因的表達[29]。擬南芥種子的萌發實驗發現MFT家族基因（Mother of FT and TELl，MFT）功能和BR信號傳導途經有關，MFT家族基因存在負反饋調節ABA機制[30]，表明BR促進種子萌發可能是作為一種基礎的代謝信號或信號途徑參與家族基因的負反饋調節，從而解除ABA在種子萌發過程中的抑制作用。紀秀娥等[27]進行種子萌發試驗發現，較低濃度BR處理以后，小麥、玉米種子的發芽效果明顯，發芽率和發芽勢等也大大提高。在水稻細胞的伸長研究中，BR促進細胞伸長具有雙重效應，其伸長量隨著濃度的增加減小，呈負相關[26]。對2種不同溫度下黃豆的萌發及下胚軸、軸根伸長的研究發現，0.05 mg/L的油菜素內酯處理后黃豆種子的萌發率高達93%[31]。在對羊草種子萌發的實驗中發現，在同等條件下表油菜素內酯對野生羊草種子發芽率值提高幅度低于GA3，但更多的表現出明顯的正互作效應，在2，4-表油菜素內酯0.1 μg/g+GA3 200 μg/g組合比單獨使用單一激素提高20%～35%，同時也顯著的提高了發芽勢[32]。說明BR促進種子萌發時與GA有協同作用，二者配合使用能更好的促進種子萌發。

2.2.4 BR對植物萌發時下胚軸伸長的生理效應

種子萌發以后長出根、莖、葉，形成幼苗。根據種子的下胚軸伸長和子葉是否留在土中可將幼苗形態建成分為子葉留土幼苗（如豌豆、蠶豆等）和子葉出土型幼苗（如棉花、油菜等）。從種子萌發到形成幼苗過程中，BR對種子萌發后下胚軸及胚根的伸長具有重要調控作用。黃豆萌芽研究發現，任何濃度BR對胚根伸長量都有一定的抑制作用，且抑制作用隨濃度升高而增強[33]，李凱榮等[34]用BR處理5種牧草種子，觀察其對種子萌發時胚根和下胚軸的影響，發現在適宜濃度時BR能夠有效促進下胚軸伸長，同時也證明BR能有效地提高軸根比例及發芽率，說明BR對植物的胚軸及胚根的伸長存在一定生理效應。從微觀角度研究發現，植物的生長和植物細胞形態建成等生理過程與微管骨架機械調節蛋白也存在一定關系。張謹[35]研究發現，BR信號調控植物下胚軸伸長需要微管骨架的參與，并在擬南芥中鑒定得到BRs信號通路中的重要轉錄因子BZR2的一個靶基因MDP40（編碼微管的去穩蛋白），通過體內外生化分析發現MDP40可以被BRs受體激酶磷酸化，磷酸化修飾的MDP40對于參與BRs調控植物下胚軸伸長具有重要意義。水稻BR不敏感突變體d61（Osbril）和BR合成缺失突變體brd1，在細胞中微管排列紊亂[26]，外源施用BR后能夠促進細胞微管的排列正常。這就證明了BR通過調控植物細胞的微管骨架的建成來促進植物下胚軸伸長。張海麗等[26]研究證明，油菜素內酯通過調節細胞有絲分裂過程中CDC48基因（cell division cycle protein 48）和縮短細胞周期的CYCD2（cyclin D2）基因的表達來促進細胞分裂伸長。以上研究結果表明，BRs促進種子萌發和胚軸伸長至少存在2種作用途徑：BR通過調控細胞分裂基因，調控細胞分裂促進下胚軸伸長；BRs信號傳遞過程中，轉錄因子BRI1通過磷酸化的MDP40調控微管動態、組織排列和穩定性，進而介導下胚軸伸長生長。

2.3 在逆境條件下BR對種子萌發的促進效應

主流植物逆境傷害學說認為，當植物處于逆境條件下體內的活性氧的代謝失調，體內活性氧的積累會破壞原生質膜，攻擊蛋白酶、DNA、RNA以及葉綠素等生物大分子，導致細胞膜破裂，細胞死亡。種子在溫度高和低、水分多和少以及鹽漬等逆境條件下萌發時體內的活性氧、自由基的含量增加，研究發現BRs能提高種子、幼苗在抗逆特性，其作用原理是BRs能提高種子貯藏和種子萌發時體內超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）以及過氧化氫酶（CAT）等酶的活性，并及時清除細胞內活性氧和自由基[36]。

2.3.1 BR在低溫逆境條件下對種子萌發的作用

植物在逆境條件下體內的自由基含量會增加，而作為消除自由基的相關酶活性在油菜素內酯處理后大大提高，辣椒低溫脅迫萌發試驗發現，用一定濃度的2，4-表油菜素內酯處理能夠解決15℃低溫下辣椒種子萌發困難，生長發育遲緩等問題[37]，這為保證早春和晚秋低溫條件下的育苗質量提供了新的解決方法。植物抗寒性與細胞膜上的不飽和脂肪酸多少以及膜質流動性等因素有關，膜上不飽和脂肪酸越多，達到相變的溫度越低。膜的流動性取決于膜磷脂上脂肪酸的組成，高比例的磷脂合成能提高膜的耐寒性[38]。而低溫條件下，細胞中自由基、活性氧的含量升高，直接攻擊細胞膜，導致細胞膜的結構受到不同程度地破壞，影響膜的整體抗寒能力；且低溫條件下，植物體內的丙二醛含量升高，增加了植物細胞膜的通透性，膜內離子外滲提高相變溫度。陳善娜等[39]研究發現，低溫脅迫下BR-120 處理后的水稻體內SOD和POX活性提高。這些酶在自由基的清除中起著重要作用。王炳奎等[40]研究發現，用BR處理后對保持SOD活性和降低丙二醛含量方面的效果都有很大的提升，說明油菜素內酯可提高種子在低溫條件下的萌發作用，一定條件下與它能提高植物體內各種保護酶的活性以及降低丙二醛含量有關。

2.3.2 BR在鹽脅迫及干旱脅迫條件下對種子萌發的作用

在鹽脅迫下，植物細胞的亞顯微結構遭到破壞，導致細胞失水，甚至死亡。研究發現BL處理后能明顯降低高鹽脅迫對細胞核和葉綠體的傷害[41]，提高植物核酸和可溶性蛋白含量[42]。在茄子鹽漬抗性試驗中，BR處理顯著提高茄子種子的發芽率、發芽勢、發芽指數及活力指數等發芽指標[43]，由此可知BR提高種子在鹽脅迫下種子萌發率與細胞可溶物的增加以及降低鹽脅迫對植物的傷害有關。玉米干旱脅迫下也有同樣效果，但對根的數量提高上基本沒有影響，主要是促進平均根長、根干重、平均芽長、芽干重等萌芽期的指標[44]，這也與早期BR提高植物抗逆性研究相一致。

3 結語

植物種子研究中，促進種子萌發、提高種子萌發率的植物內在機理研究一直都是研究的熱點。BR作為植物內源激素的分子機理及生理效應研究只有短短幾十年，但由于科研人員的不懈努力，現已成為作用機制較為清楚的植物激素之一。目前，對BR的來源、生理效應、提高植物對外界抗逆性以及在果蔬、農林方面的應用等都有了相關研究，但對油菜素內酯在植物種子萌發、幼苗細胞伸長與分裂階段的作用機理的研究還是初步階段，與IAA、ABA等內源激素在種子萌發階段的分子作用機理研究有待深入挖掘；調控細胞伸長生長中是否存在雙重效應的BR信號傳導途徑的分子機理研究以及提高逆境條件下種子萌發的作用原理研究也將作為理論結合實際應用的重要橋梁不斷深入。

參考文獻

[1] SASSE J M. Recent progress in brassinos-teroid research[J]. Physiol Plant，1997，100：696-701.

[2] 呂習棟，袁留斌. 油菜素內酯研究進展[J]. 農業災害研究，2013，03（1）：56-57，60.

[3] Mitchell J W， Mandava N， Worley J F， et al. Brassins-a new family of plant hormones from rape pollen[J]. Nature， 1970， 225（5 237）： 1 065-1 066.

[4] Grove M D， Spencer G F， Rohwedder W K. Brassinolide， a plant growth-promoting steroid isolated from Brassica napus pollen[J]. Nature，1979，281（9）： 216-217.

[5] Wang Z Y， Seto H， Fujioka S， et al. BRI1 is a critical component of a plasma-membrane receptor for plant steroids[J]. Nature， 2001， 410（3）： 380-383.

[6] Kinoshita T， Ccno-Delgado A， Seto H ， et al. Binding of brassinosteroids to the extracelluar domain of plant receptor kinase BRI1[J]. Natual， 2005， 433（1）： 167-171.

[7] 許智宏，薛紅衛. 植物激素作用的分子機理（第5版）[M]. 上海：上海科學技術出版社，2012：165.

[8] Shimada Yukihisa， Goda Hideki， Nakamura Ayako， et al. Organ-specific expression of brassinosteroid biosynthetic genes and distribution of endogenous brassinosteroids in Arabidopsis[J]. Plant Physiology， 2003，131（1）： 287-297.

[9] Teresa Montoya， Takahito Nomura， Takao Yokota， et al. Patterns of Dwarf expression and brassinosteroid accumulation in tomato reveal the importance of brassinosteroid synthesis during fruit development[J]. The Plant Journal， 2005， 42（2）： 262-269.

[10] 李 良，張洪彬，戴曉暢，等. 油菜素內酯類物質的合成及應用研究[J]. 農藥，1993，32（1）：10-11.

[11] Fujioka S， Inoue T， Takatsuto S， et al. Identification of a new brassinosteroid， cathasterone， in cultured cells of Catharanthus roseus as a biosynthetic precursor of teasterone[J]. Biosci Biotech Biochem，1995，59 （8）： 1 543-1 547.

[12] Clouse S D， Sasse J M. Brassinosteroids： essential regulators of plant growth and development[J]. Annual review of plant physiology and plant molecular biology，1998，49（6）： 427-451.

[13] 儲昭慶，李 李，宋 麗，等. 油菜素內酯生物合成與功能的研究進展[J]. 植物學通報，2006， 23（5）：543-555.

[14] Kim T W， Wang Z Y. Brassinosteroid signal transduction from receptor kinases to transcription factors[J]. Annual Review of Plant Biology， 2010， 61： 681-704.

[15] Wang Z Y， Bai M Y， Oh E， et al. Brassinosteroid signaling network and regulation of photomorphogenesis[J]. Annual Review of Genetics， 2012， 46： 701-724.

[16] Clouse S D. Brassinosteroid signal transduction：from receptor kinase activation to transcriptional networks regulating plant development[J].The Plant Cell Online， 2011， 23（4）： 1 219-1 230.

[17] He J X， Gendron J M， Yang Y， et al. The GSK3-like kinase BIN2 phosphorylates and destabilizes BZR1，a positive regu-lator of the brassinosteroid signaling pathway in Arabidopsis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2002， 99（15）： 10 185-10 190.

[18] Gampala S S， Kim T W， He J X， et al. An essential role for 14-3-3 proteins in brassinosteroid signal transduction in Arabidopsis[J]. Developmental Cell，2007，13（2）：177-189.

[19] Wang X， Chory J. Brassinosteroids regulate dissociation of BKI1，a negative regulator of BRI1 signaling， from the plasma membrane[J]. Science，2006，313 （5 790 ）： 1 118-1 122.

[20] Kim T W， Guan S， Sun Y， et al. Brassinosteroid signal trans-duction from cellsurface receptor kinases to nuclear transcription factors[J]. Nature Cell Biology， 2009，11（10）：1 254 -1 260.

[21] RYU H， KIM K， CHO H， et al. Nucleocytoplasmic shuttling of BZR1 mediated by phosphorylation is essential in Arabidopsis brassinosteroid signaling[J]. Plant Cell， 2007， 19（9）： 2 749-27 62.

[22] Bewley J D， Bradford K J， Hilhorst H W M. Physiology of development， germination and dormancy[J]. Seed Science Research， 2013， 23（4）：289.

[23] Krishnan T Joshi D K， Nagarajan S， Moharir A V. Characterization of germinating and nonviable soybean seeds by nuclear magnetic resonance （NMR） spectroscopy[J]. Seed Sci Res， 2004， 14： 355-362.

[24] 徐恒恒，黎 妮，劉樹君，等. 種子萌發及其調控的研究進展[J]. 作物學報，2014，40（7）：1 141-1 156.

[25] Romani G， Marrie M T， Bonetti A， et al. Effectsofa brassinosteroid on growth and electrogenic proton extrusion in maize root segments[J]. Physiologia Plantarum， 1983， 59（1）： 828-532.

[26] 張海麗，高 靜，張 昊，等. 油菜素內酯對水稻細胞伸長和分裂的調控[J]. 農業生物技術學報，2015，23（1）：71-79.

[27] 紀秀娥，史留功，胡春紅，等. 油菜素內酯對小麥、玉米種子萌發的影響[J]. 江蘇農業科學，2014，42（9）：88-89.

[28] 方志榮，蘇智先，胡進耀. 脫落酸、赤霉素和乙烯對種子休眠的萌發和調控[J]. 西華師范大學學報（自然科學版），2007，28（2）：127-132.

[29] 晉育丹，戴紹軍. 蛋白質磷酸化在油菜素內酯信號通路中的作用[J]. 現代農業科學，2014（6）：222-223.

[30] Xi Wanyan， Yu Hao. Mother of FT and TFL1 regulates seed germination and fertility relevant to the brassinosteroid signaling pathway[J]. Plant Signalling & Behavior， 2010， 5 （10）： 1 315-1 317.

[31] 程彥偉，柳家婷，韓建明，等. 油菜素內酯對黃豆種子萌發及下胚軸和胚根生長的影響[J]. 洛陽師范學院學報，2013，32（11）：57-59.

[32] 郭慧琴，任衛波，李 平，等. 2，4-表油菜素內酯和赤霉素互作對羊草種子萌發及幼苗生長的影響[J]. 草業科學，2014，31（6）：1 097-1 103.

[33] 程彥偉，丁 賀，韓建明，等. 天然油菜素內酯對豆

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