老年大鼠糖負荷時激素的應激性調節變化

周 珺 李茂星 王曉麗 劉文潔 賈正平 邱建國 張泉龍 張汝學

(蘭州軍區總醫院高原環境損傷防治重點實驗室 國家中醫藥管理局臨床中藥學重點學科，甘肅 蘭州 730050)

老年大鼠糖負荷時激素的應激性調節變化

周 珺 李茂星 王曉麗1劉文潔1賈正平1邱建國 張泉龍 張汝學

(蘭州軍區總醫院高原環境損傷防治重點實驗室 國家中醫藥管理局臨床中藥學重點學科，甘肅 蘭州 730050)

目的 探討老年和成年大鼠、雌性和雄性大鼠葡萄糖耐量實驗過程中，血糖、胰島素、皮質酮激素水平的應激性調節變化。方法 將大鼠分為成年雄性、成年雄性、老年雄性、老年雌性組，在葡萄糖耐量實驗過程中，分別于0、30、60、120 min采血，測定血糖值、胰島素、皮質酮水平。計算胰島β細胞功能指數(HOMAβ)和?I30/?G30。實驗結束后處死所有大鼠，測定臟器指數、胰島素、皮質酮水平。結果 相比較成年雄性大鼠，老年雌性大鼠各時間點血糖水平升高，30 min胰島素水平顯著降低(P<0.01)，0、30 min皮質酮水平降低(P<0.01)，60、120 min胰島素減少、皮質酮水平升高、臟器指數下降。相比較成年雌性大鼠，老年雌性大鼠的30、60、120 min血糖水平升高(P<0.05)、胰島素減少，各時間點皮質酮均顯著升高(P<0.05)，臟器指數均下降(P<0.05)。基礎胰島素分泌功能強弱順序：成年雌性大鼠>老年雌性大鼠>成年雌性大鼠>老年雄性大鼠。早期胰島素分泌功能強弱順序：成年雄性大鼠>成年雌性大鼠>老年雄性大鼠>老年雌性大鼠。結論 老年大鼠胰島素發揮作用具有延時或胰島素敏感性下降的特點，尤其是老年雌性大鼠。不同性別老年大鼠皮質酮反應性不同，機體臟器均有萎縮，基礎和早期胰島素分泌功能均較差。

糖耐量試驗；血糖；胰島素；皮質酮

葡萄糖耐量進行性降低與老化呈正比關系，糖耐量受損(IGT)和2型糖尿病(T2DM)在老年人中發病率顯著升高〔1〕。大量研究發現，下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸的高活性與老化相關的認知功能下降以及神經元存活的狀況密切相關，衰老導致的HPA軸缺損在同種系內部廣泛存在。有證據表明，糖皮質激素的調控在老化過程中受損，這與衰老導致的心血管事件、神經內分泌調節紊亂密切相關〔2〕。前期研究發現T2DM患者HPA軸的功能異常，糖皮質激素的調節受損程度與糖化血紅蛋白(HbA1c)水平密切相關〔3〕。另有研究發現，相比較成年大鼠和中年大鼠，老年大鼠的促腎腺皮質激素釋放激素(ACTH)和皮質酮(CORT)水平在應激刺激下的反應性個體差異特別大〔4〕，HPA軸功能正常對大鼠葡萄糖穩態必不可少〔5〕。本實驗擬初步了解在葡萄糖負荷的應激刺激下不同時間點，老年大鼠和成年大鼠、雌性大鼠和雄性大鼠胰島素和皮質激素的變化情況，分析糖皮質激素調控的差異。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Wistar雄性、雌性14周齡大鼠各10只，體重(180±10)g分別為成年雄性組、成年雌性組；Wistar雄性、雌性60周齡大鼠各10只，體重(400±10)g為老年雄性組；Wistar雌性60周齡大鼠10只，體重(200±10)g為老年雌性組。所用大鼠均由蘭州大學醫學院動物實驗中心提供，生產許可證號：SCXK(甘)2009-0004，動物合格證號：No.0000789，飼養于蘭州軍區蘭州總醫院動物實驗科，普通飼料由該實驗科自行配制，自由攝食進水，室溫19℃～24℃。所有大鼠自由進食、進水，適應性喂養1 w后進行實驗，實驗時間為5 w。

1.2 實驗儀器 Vitalab 21半自動生化分析儀，荷蘭Vital Scientific公司；BP210S電子天平，賽多利斯有限公司；HP-8453紫外分光光度計，美國惠普公司；IEC MICROMAX離心機，美國Thermo Electron公司；SN-682放射免疫γ-計數器，中國科學院上海原子核研究所日環儀器廠。

1.3 藥品與試劑 血糖檢測試劑盒(批號：1211105)購自四川省邁克科技有限責任公司；50%葡萄糖注射液(批號:10041108)，湖南中南科倫藥業有限公司；胰島素(FINS)放射免疫分析試劑盒(批號：20101120)、CORT放射免疫分析試劑盒(批號：20100920)為天津九鼎生物技術有限公司產品；其他試劑均為國產分析純。

1.4 實驗方法

1.4.1 糖耐量實驗(OGTT)測定 大鼠禁食6 h，乙醚麻醉后眼眶靜脈叢采血，測定空腹血糖，即為0 min血糖。腹腔一次性注射葡萄糖溶液2.5 g/kg，分別于注射后30、60、120 min采血，測定血糖值。血糖用葡萄糖氧化酶法測定。

1.4.2 血漿FINS及CORT含量測定 糖耐量實驗0、 30、60、120 min的血樣以及大鼠處死后血樣用肝素鈉抗凝后，6 000 r/min離心4 min后分裝待測，血漿FINS、CORT含量用放射免疫法進行測定，具體操作參見試劑盒說明書。

1.4.3 臟器指數測定 處死大鼠后立即解剖并取出相應臟器，洗凈后稱重(內臟指數=內臟重/體重×100%)。

1.4.4 早期和基礎胰島素分泌功能 采用HOMAβ反映基礎胰島素分泌功能〔6〕：HOMAβ= 20×Ⅰ0/(G0-3.5)。采用?Ⅰ30/?G30反映早期胰島素分泌功能〔7〕：?Ⅰ30/?G30=(Ⅰ30-Ⅰ0)/(G30-G0)。

2 結 果

2.1 OGTT過程中血糖水平的變化 在OGTT中，相比較成年雄性大鼠，老年雄性大鼠各時間點血糖水平升高，但僅0、60、120 min血糖水平具有統計學差異(P<0.05，P<0.01)。相比較成年雌性大鼠，老年雌性大鼠的30、60、120 min血糖水平顯著升高(P<0.05，P<0.01)，且老年雌性大鼠的60、120 min血糖水平均高于老年雄性大鼠。見表1。

2.2 OGTT過程中FINS水平的變化 在OGTT中，相比較成年雄性大鼠，老年雄性大鼠的30 min FINS水平顯著降低(P<0.01)，60、120 min在葡萄糖刺激下生成FINS均不同程度的減少。相比較成年雌性大鼠，老年雌性大鼠的30 min FINS水平顯著降低(P<0.01)，60、120 min在葡萄糖刺激下生成FINS均不同程度減少。各組大鼠處死后的血漿胰島素水平無統計學差異(P>0.05)。見表2。

2.3 OGTT過程中CORT水平的變化 相比較成年雄性大鼠，老年雄性大鼠的0、30 min CORT水平顯著降低(P<0.01)，60、120 min CORT水平升高，與成年雄性大鼠無統計學差異(P>0.05)。相比較成年雌性大鼠，老年雌性大鼠的0、30、60、120 min CORT水平均顯著升高(P<0.05)。處死后，老年雌性大鼠的血漿CORT水平仍顯著高于其他各組，差異有統計學意義(P<0.01)。見表3。

表1 各組OGTT過程中血糖水平的變化

與成年雄性組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與成年雌性組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；與老年雄性組比較：5)P<0.05，6)P<0.01；下表同

表2 OGTT過程中FINS水平的變化

表3 各組OGTT過程中CORT水平的變化

2.4 臟器指數的變化 相比較成年雄性大鼠，老年雄性大鼠的肝臟指數顯著下降(P<0.01)，脾臟指數、腎臟指數、腎上腺指數均不同程度的下降。相比較成年雌性大鼠，老年雌性大鼠的肝臟指數、脾臟指數、腎臟指數、腎上腺指數均顯著下降(P<0.05)。見表4。

表4 各組臟器指數的變化±s)

2.5 基礎和早期胰島素分泌功能評價 相比較成年雄性大鼠，老年雄性大鼠和成年雌性大鼠的HOMAβ下降，同時，其他各組?Ⅰ30/?G30均下降；相比較成年雌性大鼠，老年雌性大鼠的HOMAβ升高，?Ⅰ30/?G30下降。說明基礎胰島素分泌功能強弱順序：成年雄性大鼠>老年雄性大鼠>成年雌性大鼠>老年雄性大鼠。早期胰島素分泌功能強弱順序：成年雄性大鼠>成年雌性大鼠>老年雄性大鼠>老年雌性大鼠。見表5。

表5 各組基礎和早期胰島素分泌功能評價±s)

3 討 論

葡萄糖耐量減弱與老化密切相關，老齡化導致IGT和T2DM在老年人中發病率升高〔1〕。導致這種情況的主要原因是各種原因導致的老年患者葡萄糖利用減少以及葡萄糖來源增加。HPA軸的高活性與老化相關的認知功能下降、機體神經內分泌調節障礙等密切相關，衰老可導致HPA軸功能紊亂，糖皮質激素調控異常〔2〕。HPA軸功能正常對大鼠葡萄糖穩態必不可少〔5〕，但是很少有人知道這個內分泌軸在衰老大鼠糖穩態調節方面的重要性以及此軸的性別差異。

隨著年齡的增加，老年化常伴隨葡萄糖穩態受損程度的增加以及T2DM發生率增加。隨著衰老的加重，胰島β細胞的分泌功能降低〔8〕。研究證實，在老年人群中，許多和老化相關因素之間的相互作用都可促進老化相關的改變，這些在OGTT過程中都可以得到體現〔9〕。Gu等〔10〕研究發現隨著年齡的增長，胰島β細胞功能逐漸下降，老年大鼠β細胞增殖減少且凋亡的β細胞頻率顯著增加，β細胞的FINS分泌功能降低。

本實驗間接說明HPA軸的功能狀態不同，差異較大。主要原因為老年大鼠臟器一定程度萎縮、臟器功能減弱以及其他激素調節失衡的間接影響。

葡萄糖耐量降低存在胰島素β細胞功能缺陷和胰島素抵抗等病理生理狀態，且具有血管病變的多種風險因子的臨床特點〔10〕。本實驗一次性注射大劑量的葡萄糖對大鼠機體也是一種應激刺激，在這種應激刺激下，衰老大鼠出現腎上腺束狀帶細胞肥大，下丘腦區域神經元缺損，海馬糖皮質激素受體減少，血中ACTH和糖皮質激素水平升高，下丘腦CRH釋放增加；給予地塞米松后內源性GC的抑制作用減弱，對慢性應激反應性的緩解性降低。根據GC級聯作用的假設，應激刺激和GC促進大鼠的老化。應激誘導海馬組織糖皮質激素受體下調，然后使應激誘導的HPA軸激活GC負反饋受損，最終CORT的基礎水平升高以及應激刺激的GC分泌增加。由于海馬的激活減弱HPA軸功能，GC濃度過度升高以及海馬組織內糖皮質激素受體水平降低可逐步減弱其負反饋機制并使應激反應性遲鈍〔5〕。

綜上，老年雌鼠對應激刺激的敏感性依舊存在，主要表現為HPA軸功能亢進，而老年雄鼠更多地表現為HPA軸過分亢進最終導致糖皮質激素的耗竭。老年雌性大鼠比老年雄性大鼠更加嚴重的原因很可能是由于性激素的差異。

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5 Wang PS，Lo MJ，Kau MM.Glucocorticoids and aging〔J〕.J Formos Med Assoc，1997;96(10):792-801.

6 Hanson RL，Pratley RE，Bogardus C，etal.Evaluation of simple indices of insulin sensitivity and insulin secretion for use in epidemiologic studies〔J〕.Am J Epidemiol，2000;151(2):190-8.

7 Haffter SM，Kennedy E，Gonzalez C，etal.A prospective analysis of the HOMA model.The Mexico City Diabetes Study〔J〕.Diabetes Care，1996;19(10):1138-41.

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〔2014-08-20修回〕

(編輯 徐 杰)

Changes of hormonal stressful regulation of older rats in glucose-tolerance

ZHOU Jun，LI Mao-Xing,WANG Xiao-Li，etal.

Key Laboratory of Prevention and Cure for Plateau Environment Damage，PLA;Clinical Pharmacy Key Discipline of State Administration of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730050，Gansu，China

Objective To investigate the blood glucose，insulin level and corticosterone levels variation in glucose tolerance test between older and younger rats，male and female rats，to explore the stressful regulation changes of these hormones.Methods Rats were divided into four groups:adults male，adults female，older male，older female. The glucose tolerance test was conducted，the rat’s blood was collected at 0，30，60，120 min each point，the levels of glucose，insulin and corticosterone were measured. After experiment，all rats were decapitated，the levels of insulin and corticosterone were measured，and the organ indexes were assayed. Then the HOMAβ and △I30/△G30were accounted.Results In glucose tolerance test，compared with that of adults male rats，older male rats’ blood glucose levels was raised at each time point，its insulin levels at 30 min was significantly decreased(P<0.01)，while at 60 and 120 min also decreased，the corticosterone levels was reduced notably at 0 and 30 min(P<0.01)，while increased at 60 and 120 min，organ index lowered in different degree. Compared with those of adults female rats，older female rats’ blood glucose level was raised significantly at 30，60，120 min(P<0.05)，its insulin level at 30 min was significantly decreased(P<0.01)，while at 60 and 120 min also decreased，the corticosterone level was increased notably at each time point(P<0.05). After death，the corticosterone level was higher than that of other groups(P<0.01)，the organ indexes were decreased notably(P<0.05). The order of basal insulin secretion function:adult male >older female > adult female > older male. The order of prophase insulin secretion function:adult male > adult female > older male > older female.Conclusions Insulin is delayed to produce a marked effect or the sensitivity is declined in older rats，especially the older female rats. The corticosterone levels variation in different gender，the organ indexes are atrophy，and the insulin secretion function in basal and prophase is declined.

Glucose tolerance test;Blood glucose;Insulin;Corticosterone

國家自然科學基金資助項目(No.81173620，30772773)

張汝學(1963-)，男，碩士生導師，教授，主要從事內分泌代謝藥理學研究。

周 珺(1986-)，女，藥師，碩士，主要從事藥理學研究。

R335

〔文章編號〕 1005-9202(2015)12-3191-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.003

1 蘭州大學藥學院