炎癥因子對心肌間質的影響及缺血后處理對其保護作用

宋 娟 李寶紅 盧彥珍 宋曉亮 王 佳 冀菁荃

(長治醫學院病理生理學教研室，山西 長治 046000)

炎癥因子對心肌間質的影響及缺血后處理對其保護作用

宋 娟 李寶紅 盧彥珍 宋曉亮1王 佳2冀菁荃

(長治醫學院病理生理學教研室，山西 長治 046000)

目的 探討缺血后處理對大鼠心臟缺血-再灌注損傷中腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細胞介素(IL)-6的影響，及其對心肌間質和心臟功能的保護作用。方法 將24只雄性SD大鼠隨機分為三組，假手術對照組(SC組，n=8)、缺血-再灌注組(I/R組，n=8)和缺血后處理組(IPTC組，n=8)，結扎左冠狀動脈前降支造成缺血-再灌注損傷動物模型。通過心室內插管、多導生理記錄儀監測左室血流動力學變化，計算心肌組織中膠原含量變化，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒檢測血漿中TNF-α和IL-6濃度改變，Western印跡檢測基質金屬蛋白酶(MMP)-2表達情況。結果 與SC組比較I/R組血漿TNF-α和IL-6濃度升高，同時心肌MMP-2蛋白明顯升高，而心肌膠原含量下降并伴隨左室心功能下降；IPTC組在血漿TNF-α和IL-6濃度明顯降低的同時，心肌MMP-2蛋白也明顯降低，而心肌膠原含量、左室舒縮功能明顯高于I/R組。結論 IPTC對缺血-再灌注損傷心肌有保護作用，機制可能與其減少炎性介質TNF-α和IL-6的釋放以抑制MMP-2的表達，從而減輕心肌間質的損傷有關。

缺血后處理；缺血-再灌注損傷；基質金屬蛋白酶；白細胞介素-6；腫瘤壞死因子-α

缺血-再灌注(I/R)損傷不但損傷心肌細胞本身，同時嚴重損傷心肌間質，并引起組織的無菌性炎癥反應〔1〕。I/R損傷的病理生理機制極為復雜，目前認為造成心肌I/R損傷的機制之一是炎癥因子的過度表達〔2〕。細胞因子尤其是腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6作為重要的炎性介質在心肌I/R損傷的病理生理過程中起著重要的作用。因此防治心肌I/R損傷的有效辦法除盡快恢復心肌血流的再灌注外，如何拮抗炎癥因子的過度表達所造成的心肌損傷是目前研究的主要方向。有研究表明缺血后處理(IPTC)可通過抑制炎癥因子釋放發揮抗炎效應和心肌保護作用〔3〕，但目前的研究基本集中在對心肌細胞的保護上，前期研究結果顯示，IPTC對心肌間質有保護作用〔4〕，具體是通過抑制基質金屬蛋白酶(MMP)-2的活性和表達減少心肌間質的降解發揮保護作用的。但IPTC是否可通過抑制炎性反應影響心肌間質產生心肌保護作用研究較少。本實驗探討IPTC減輕炎性反應對心肌間質的影響并觀察其與心肌間質和心功能的關系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器 羊抗鼠MMP-2多克隆抗體、鼠抗小鼠β-action單克隆抗體、堿性磷酸酶標記的二抗IgG購自Santa Cruz公司， TNF-a、IL-6 ELISA試劑盒購自美國R&D公司。

1.2 動物分組 健康成年雄性SD大鼠24只，體重(250±30)g，20%的烏拉坦(1 g/kg ip)麻醉，隨機分為三組：①假手術對照組(SC)；②缺血-再灌注組(I/R)；③缺血后處理組(IPTC)，每組8只。

1.3 模型制備 動物仰臥位固定于手術臺上。小動物人工呼吸機維持通氣，行胸骨正中切開，以左冠狀靜脈主干為標志，在左心耳根部下方2 mm處進針結扎，以阻斷左冠狀動脈前降支，結扎20 min，然后恢復血液灌流40 min，假手術對照組除不結扎冠狀動脈外，其余同I/R組。缺血后處理動物模型按Zhao等〔5〕的方法復制，即缺血完畢，灌注30 s、缺血30 s，連續3個循環，然后再灌注40 min結束實驗。復制模型的可靠性用連續監視心電圖Ⅱ導聯的變化來判斷，結扎后心電圖ST段抬高，解除結扎血管復通后ST段下降1/2以上為模型成功。

1.4 方法

1.4.1 左室功能測定 20%烏拉坦(1 g/kg ip)麻醉動物，固定，頸正中切口，暴露氣管及動脈，從右頸總動脈插入內充37℃肝素生理鹽水PE-50軟質塑料導管至左心室，接壓力傳感器，連接多導生理記錄儀，穩定后計算機程序處理，輸出左心室壓力(LVP)信號，記錄左心室峰壓(LVSP)、左室內壓上升及下降最大速率(±dp/dtmax)及Ⅱ導心電圖。

1.4.2 心肌中膠原含量測定 按文獻方法〔6〕，稱取凍存左室心肌約100 mg，脫水、脫脂、烘干、稱重，加入6 mol/L HCl 3 ml，105℃烘箱烤16 h。冷卻后調pH為6，加去離子水至10 ml，5 600 r/min離心，取上清2 ml作檢測。按要求配制標準管和空白管，用Beckman紫外分光光度計，波長550 nm，1 cm光徑，水調零，測各管A值，計算出羥脯氨酸含量。由于羥脯氨酸在膠原中占13.4%，心肌膠原含量(mg/g干重心肌)=羥脯氨酸含量×7.46。

1.4.3 血漿血清TNF-α、IL-6測定 實驗結束，處死動物前，經股動脈抽血4 ml左右，離心后收集血清貯存于-70℃冰箱內備用。嚴格按說明書應用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法測定血清TNF-α、IL-6的濃度。

1.4.4 Western印跡測定MMP-2蛋白 取液氮凍存心肌組織勻漿、離心，分離上清得MMP-2 提取液，采用考馬斯亮藍法進行蛋白質定量，以20 μg蛋白/泳道上樣于8%SDS 聚丙烯酰胺凝膠上電泳后，電轉膜至PVDF膜上。室溫封閉3 h，加一抗，室溫孵育2 h，洗滌后，加二抗，室溫孵育2 h，洗滌后，顯色，待蛋白條帶顯色清晰時，拍攝照片，記錄實驗結果。

1.5 統計學方法 采用SPSS14.0軟件包進行單因素方差分析及q檢驗。

2 結 果

2.1 IPTC對心肌I/R損傷時心臟動力學參數的影響 與SC組相比較，I/R組LVSP、±dp/dtmax均下降，兩者相比有顯著差異(P<0.01)；IPTC組三項指標顯著改善(P<0.05)。見表1。

表1 IPTC對心肌I/R損傷大鼠心臟動力學參數的影響

與SC組比較：1)P<0.01；與I/R組比較：2)P<0.05，3)P<0.01

2.2 大鼠心肌膠原含量和血漿TNF-α、IL-6含量的變化 與SC組相比較，I/R組血漿TNF-α、IL-6含量顯著升高，心肌膠原含量明顯減少(P<0.01)。與I/R組相比，IPTC組心肌膠原含量明顯升高，而血漿TNF-α、IL-6含量明顯降低(P<0.01)。見表2。

表2 各組心肌膠原含量和血漿TNF-α、IL-6含量的變化

與SC組比較：1)P<0.01；與I/R組比較：2)P<0.01

2.3 Western印跡測定MMP-2表達結果 如圖1所示，在SC組，MMP-2有一定程度的表達，缺血20 min再灌注40 min后，心肌組織中MMP-2表達較SC組明顯升高。而缺血后，灌注30 s、缺血30 s，連續3個循環，然后再灌注40 min的IPTC組MMP-2的表達較I/R組明顯降低。

圖1 Western印跡檢測心肌MMP-2的表達

3 討 論

心臟功能的正常運轉不僅依賴于心肌細胞，很大程度上也取決于組成心臟的非心肌細胞結構、功能的正常與否。構成心臟的非心肌細胞占心臟細胞總數的60%以上，所以心臟功能障礙不僅表現為心肌細胞的壞死、凋亡、肥大等，也與細胞外間質的狀態密切相關。近年來，IPTC對心肌I/R損傷的保護作用越來越多地受到大家的關注，IPTC即于完全再灌注之前給予組織多次短暫I/R的過程，以提高組織的適應性。但是對于IPTC保護心臟功能的機制研究多集中于心肌細胞本身，對細胞外基質的研究較少。本實驗研究發現，缺血20 min再灌注40 min使心肌羥脯氨酸含量明顯減少，而IPTC組心肌羥脯氨酸含量明顯升高。由于羥脯氨酸在膠原中占13.4%，組織羥脯氨酸含量的測定是衡量機體膠原代謝的重要指標，從羥脯氨酸含量可推知膠原的含量。即IPTC組動物心肌膠原含量明顯升高。與此同時I/R組LVSP、±dp/dtmax均明顯低于SC組，而IPTC組三項指標明顯改善，提示缺血后處理可能通過增加心肌間質膠原含量發揮保護心肌、提高心功能的作用。

MMPs是一組降解細胞外基質的鈣離子和鋅離子依賴的金屬蛋白內切酶家族，對細胞外基質(ECM)有較高親和力，是ECM降解的主要介質〔7〕。有研究表明， MMPs特別是MMP-2在I/R損傷導致的急性心功能障礙發生時能迅速影響心肌功能〔8〕， 在充血性心力衰竭患者血清中MMP-2濃度顯著升高，且隨著心衰程度的加重而升高〔9〕。正常心肌中，MMPs表達水平相對較低，在一些病理情況下，如炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的刺激下可誘導其基因轉錄活性增強，導致其表達增加〔10〕。在眾多的炎性介質中， IL-6和TNF-α是較為公認的促進炎癥發展的細胞因子。且有研究證實IL-6能夠調節MMP-2和MMP-9的表達〔11〕。本實驗中觀察到，缺血20 min再灌注40 min后，血漿TNF-α、IL-6含量明顯升高的同時Western印跡結果提示在I/R過程中，有炎癥因子的大量釋放，導致心肌MMPs激活，從而降解心肌膠原蛋白導致心功能下降。IPTC的心肌保護作用可能在于影響了炎癥因子的釋放，減弱了MMPs的活化，從而減少了心肌ECM的降解以發揮保護心臟的功能。

本研究表明，IPTC在發揮保護心肌保護作用時，不僅是在心肌細胞層面，而且對細胞外基質的保護也是其重要的機制之一。通過減少炎癥因子的釋放抑制MMP-2的活性，從而減輕心肌間質的損傷，是IPTC發揮心肌保護作用的重要途徑之一。

1 Kawaguchi M，Takahashi M，Hata T，etal. Inflammasome activation of cardiac fibroblasts is essential for myocardial ischemia/reperfusion injury〔J〕．Circulation，2011；123(6)：594-604.

2 Sleffens S，Montecucco F，Mach F．The inflammatory response as a target to reduce myocardial ischaemia and reperfusion injury〔J〕．Thromb Haemost，2009；102(2)：240-7.

3 Xiong J，Wang Q，Xue FS，etal．Comparison of cardioprotective and anti-inflammatory effects of ischemia pre- and postconditioning in rats with myocardial ischemia-reperfusion injury〔J〕．Inflamm Res，2011；60(6):547-54.

4 盧彥珍，張翠英，王 佳，等．缺血后處理對缺血再灌注大鼠心肌間質的保護作用〔J〕．長治醫學院學報，2011;25(3)：164-7.

5 Zhao ZQ，Corvera JS，Halkos ME，etal．Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion：comparison with ischemic preconditioning〔J〕．Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003；285(2)：579-88.

6 Chiariello M，Ambrosio G，Cappelli-Bigazzi M，etal.A biochemical method for the quantitation of myocardial scarring after experimental coronary artery occlusion〔J〕．J Mol Cell Cardiol，1986;18(3)：283-90.

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8 Jacob-Ferreira AL，Schulz R. Activation of intracellular matrix metalloproteinase-2 by reactive oxygen-nitrogen species:consequences and therapeutic strategies in the heart〔J〕. Arch Biochem Biophys，2013;540(1-2):82-93.

9 董兆強，鹿慶華，郝 林，等.充血性心力衰竭患者血清基質金屬蛋白酶-2濃度的變化及其臨床意義〔J〕．中國老年學雜志，2007;27(6)：548-50．

10 Liu XY，Zhang SM．After cerebral ischemia reperfusion in rats and the expression of MMP-9 and E—selectin synthetic intervention effect 〔J〕．Chin J Clin Neurosci，2010；18(2)：119-25.

11 Sun W，Liu DB，Li WW，etal.Interleukin-6 promotes the migration and invasion of nasopharyngeal carcinoma cell lines and upregulates the expression of MMP-2 and MMP-9〔J〕．Int J Oncol，2014；44(5):1551-60．

〔2014-03-17修回〕

(編輯 安冉冉/曹夢園)

山西省自然科學基金資助項目(No.2009011055)；山西省2013年國家級大學生創新創業訓練計劃資助項目(No.2013083)

盧彥珍(1957-)，女，教授，主要從事心血管保護機制的研究。

宋 娟(1980-)，女，碩士，講師，主要從事心血管保護及炎癥發病機制的研究。

R541

A

1005-9202(2015)12-3209-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.010

1 長治醫學院藥理學教研室 2 長治醫學院免疫學教研室