高鹽誘導Wistar大鼠腎損害的機制及替米沙坦的干預效果

王曉春 商黔惠 石耿輝

(遵義醫學院臨床醫學研究所高血壓研究室，遵義 貴州 563003)

高鹽誘導Wistar大鼠腎損害的機制及替米沙坦的干預效果

王曉春 商黔惠 石耿輝

(遵義醫學院臨床醫學研究所高血壓研究室，遵義 貴州 563003)

目的 探討長期高鹽飲食導致Wistar大鼠腎臟損害的機制及替米沙坦干預效果。方法 雄性Wistar大鼠49只，隨機分為對照組(NS組，n=13，用含0.5%NaCl顆粒飼料喂養)、高鹽組(n=24，用含8%NaCl顆粒飼料喂養)、干預組(GY組，n=12，用含8%NaCl顆粒飼料喂養+替米沙坦灌胃)，均自由飲水，飼養24 w。實驗結束時用尾動脈測壓儀測血壓，用代謝籠收集24 h尿液測定尿蛋白量，HE染色觀察腎皮質形態學的改變，生化方法測定腎組織超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、鈉泵(Na+-K+-ATPase)和鈣泵(Ca2+-ATPase)活性；Western印跡法檢測腎組織過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)蛋白的表達。結果 與NS組比較，24 w時高鹽組部分大鼠血壓增高，將血壓升高大鼠，分為高鹽高血壓組(HH組，n=13)其余大鼠分為高鹽正常血壓組(HN組，n=11)；HH組和HN組大鼠腎組織均有大量炎癥細胞浸潤，尿蛋白排泄增多，總SOD活力、Ca2+-ATPase活性降低(P<0.05)，PPAR-γ蛋白表達增高(P<0.05)，而GY組大鼠腎組織炎癥細胞浸潤程度、尿蛋白排泄量均較高鹽組低。結論 長期高鹽飲食飼養可導致Wistar大鼠的腎損害，其可能與炎癥和氧化應激有關，PPAR-γ蛋白表達的增高可能對腎損害有拮抗作用。替米沙坦可能通過降低尿蛋白的排泄和抑制炎癥反應對腎臟起保護作用。

氧化應激；過氧化物酶體增殖物激活受體-γ

大量的臨床試驗和動物研究均證實，高鹽有獨立于血壓的腎損害作用。Schindler等〔1〕發現炎癥反應、氧化應激與慢性腎功能不全關系密切。過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)-γ可通過調控炎性反應而阻止腎臟纖維化的進展，其激動劑能使高血壓大鼠模型血壓降低〔2〕。目前，高鹽與氧化應激和炎癥反應之間關系的研究報道較少，本實驗旨在觀察長期高鹽飲食飼養對Wistar大鼠腎組織炎癥反應、氧化應激和PPAR-γ蛋白表達的影響及替米沙坦的干預作用。

1 材料與方法

1.1 動物分組 80～100 g的雄性Wistar大鼠49只〔合格證號：SCXK-(渝)2007-0005〕，置于室溫22℃～25℃、相對濕度45%的動物房內飼養，采用顆粒飼料〔合格證號：SCXK-(粵)2008-0002〕喂養且自由飲水。隨機分為對照組(NS組，n=13，含0.5%NaCl顆粒飼料喂養)、高鹽組(n=24，含8%NaCl顆粒飼料喂養)、干預組(GY組，n=12，含8%NaCl顆粒飼料喂養+替米沙坦灌胃)，均飼養24 w。

1.2 尾動脈收縮壓測量 標準尾部測壓法測量實驗前及24 w時的尾動脈收縮壓，每只大鼠測量5次，每次間隔1 min，取5次測量的平均值作為大鼠尾動脈收縮壓。

1.3 尿蛋白測定 24 w時，用代謝籠收集24 h尿液，測定24 h尿微量白蛋白和24 h尿總蛋白。

1.4 取材及腎組織指標的檢測 24 w時斷頭處死大鼠，迅速摘取左側腎臟投入冰冷的生理鹽水中清洗，清洗完畢后置濾紙上吸干，將左腎沿長軸冠狀切為三部分，取中間厚約0.2～0.3 cm的組織塊在冰冷的生理鹽水中漂洗，置濾紙上吸干，放入盛有4%多聚甲醛緩沖液中，室溫下固定24 h，石蠟包埋，切片，HE染色；取左腎腹側部分皮質于-80℃冰箱中凍存，用于檢測總超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量、鈉泵(Na+-K+-ATPase)及鈣泵(Ca2+-ATPase)活性，背側部分皮質于-80℃冰箱中凍存，用于Western印跡法檢測PPAR-γ蛋白的表達。

1.5 Western印跡的檢測 取適量腎皮質加入RIPA裂解液(強)中，充分裂解后離心取上清液，根據BCA法蛋白定量試劑盒操作步驟測定蛋白原液濃度，蛋白定量(100 mg/10 μl)，配8%的分離膠及5%積層膠，取10 μl總蛋白加入 2×SDS-PAGE，總體積為20 μl，混勻，煮沸5 min變性，加樣，80 V電壓跑積層膠，120 V電壓跑分離膠，根據各條帶情況決定電泳時間，當溴酚藍染液到達分離膠底邊時，停止電泳；電轉至PVDF膜。5%脫脂奶粉或1%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，0.1%TBST洗膜3次，每次10 min，加入一抗(濃度1∶500)4℃孵育過夜，0.1%TBST洗膜3次，每次10 min，室溫下加入二抗(濃度1∶1 000)孵育1 h，再次0.1%TBST洗膜3次，每次10 min。將混合好的ECL工作液均勻加至PVDF膜上，曝光顯影成像。用SYNGENE凝膠圖像分析儀進行結果的分析。

1.6 統計學方法 使用SPSS16.0軟件。組間正態分布資料比較采用單因素方差分析，方差齊使用LSD法，方差不齊使用Tamhane′s T2法，偏態分布資料比較采用秩和檢驗；兩變量間的相關性分析使用Pearson法。

2 結 果

2.1 尾動脈收縮壓測量結果 各組大鼠基礎尾動脈收縮壓相似。實驗24 w時，與NS組比較，高鹽組部分大鼠尾動脈收縮壓增高。因此，根據大鼠尾動脈收縮壓測定結果及顧德官等〔3〕的大鼠高血壓判定標準，將高鹽組分為高鹽高血壓組(HH組，n=13)、高鹽正常血壓組(HN組，n=11)。HH組與其余各組比較，實驗24 w時血壓均明顯增高，見圖1。

2.2 HE染色結果 24 w時，與NS組比較，HH組、HN組大鼠腎皮質區有大量炎癥細胞浸潤，而GY組大鼠腎皮質炎癥細胞的浸潤較HH組、HN組均更少，見圖2。

2.3 24 w時組間尿蛋白比較 見表1。24 w時，與NS組比較，HH組、HN組的24 h尿微量白蛋白和總蛋白均增高；且GY組較HH組、HN組降低。

2.4 大鼠腎皮質組織各指標比較 見表2。

2.5 相關性分析 高鹽組大鼠24 h尿微量白蛋白和總蛋白的排泄與腎組織總SOD活力、Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性均無相關性，但高鹽組大鼠腎組織總SOD活力與Ca2+-ATPase活性呈顯著正相關(r=0.574，P=0.003，n=24)，見圖3。

2.6 Western印跡法檢測腎皮質PPAR-γ蛋白表達結果 與NS組(0.22±0.03)比較，實驗24 w時HH組(0.70±0.14)、HN組(0.43±0.11)大鼠腎皮質PPAR-γ蛋白的相對表達增高(P<0.05)；與HH組比較，HN組、GY組(0.42±0.09)腎皮質區PPAR-γ蛋白的表達降低(P<0.05)，見圖4。

與HH組比較：1)P<0.05

圖2 Wistar大鼠腎皮質HE染色(×200)

表1 24 w時各組尿蛋白比較

組別n24h尿微量白蛋白平均秩次χ2值P值24h尿總蛋白平均秩次χ2值P值NS組138 2127 510 0023 3116 620 00HH組1336 9236 46HN組1128 6426 18GY組1223 5413 33

表2 腎皮質總SOD活力、MDA含量、Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性比較

與NS組比較：1)P<0.05

圖3 高鹽組大鼠腎皮質總SOD活力與Ca2+-ATPase活性的相關性

圖4 腎皮質PPAR-γ蛋白的相對表達

3 討 論

近年來國內外動物研究均發現高鹽飲食可以引起Wistar大鼠血壓增高，有獨立于血壓的靶器官損害作用〔4，5〕。本研究結果與上述研究發現相一致，不同的是，既往文獻鮮見長期高鹽飲食飼養Wistar大鼠發現血壓僅部分增高的報道，其原因考慮可能與不同研究使用的高鹽濃度和飼養時間長短不一所致有關。

氧化應激存在于腎臟病的始末，參與其發生、發展，是影響慢性腎臟病患者預后的重要危險因素〔6〕。生理情況下腎臟的抗氧化能力與氧自由基的氧化能力相平衡，可保持細胞的正常生存。當腎臟細胞產生過多的氧自由基或腎臟疾病使其抗氧化能力下降時，就會引起或加重腎臟損傷〔7〕。SOD是較好的抗氧化指標，慢性腎功能不全患者SOD 明顯缺乏時，過量的氧自由基即可引起腎組織細胞損傷。此外，大量研究證實，ROS還可以作為重要的細胞內信使，對鈣離子信號傳遞、蛋白質磷酸化過程及轉錄因子等均有不同的作用，通過活化許多信號傳導通路，間接導致組織損傷。近年來研究顯示O2-和H2O2都能抑制細胞膜Ca2+-ATPase活性，胞質游離Ca2+排出障礙，細胞內Ca2+超載可引發氧自由基的產生，引起或促進靶器官的損害，而高鹽可誘發或加重氧化應激〔8，9〕。本實驗結果推測長期高鹽飲食可使Wistar大鼠腎組織抗氧化能力減弱，氧自由基生成增多，進而抑制細胞膜Ca2+-ATPase活性，使胞質游離Ca2+排出障礙，細胞內Ca2+超載又進一步加重氧自由基的產生，兩者形成惡性循環，逐漸誘發和加重腎損害。

研究〔10,11〕表明PPARs參與機體多種生理和病理過程，PAR-γ作為PPARs的亞型之一，具有多種生物效應，在糖代謝、脂質代謝、動脈粥樣硬化形成及炎性反應中起重要作用，是一個炎癥反應調節劑，可調節炎癥相關基因的表達。PPARγ活化后不僅積極調節腎臟組織細胞的分化和凋亡，還可以逆轉腎小球硬化和間質纖維化進展，在腎臟疾病中發揮抗炎、降壓、降蛋白尿等腎臟保護作用〔12，13〕。對人類及腎臟病動物模型研究發現，過氧化物酶增殖物激活受體激動劑羅格列酮可減輕腎臟病的蛋白尿，抑制腎臟纖維化〔14〕；Villegas等〔15〕報道羅格列酮具有增加SOD活性，進而減少ROS的產生，以對抗氧化應激的作用。Li等〔16〕研究表明，與WKY比較，自發性高血壓大鼠(SHR)腎、肝、心、腦等組織的炎癥相關因子表達增強，總抗氧化能力水平顯著降低，而PPAR-γ蛋白表達增加。本實驗研究結果顯示高鹽組腎組織均有炎癥細胞的浸潤，SOD活力下降，而PPAR-γ蛋白的相對表達卻增高，由此推測長期高鹽飲食誘導Wistar大鼠腎損害的機制與炎癥反應和氧化應激有關，而PPAR-γ蛋白表達的上調可能是機體的一種保護性反應。

近年來，研究表明尿蛋白作為一個獨立的致病因素與腎臟疾病的發生和發展有關〔17〕。Sugiyama等〔18，19〕研究發現長期替米沙坦治療可通過降低尿蛋白，抑制上皮間質細胞轉化、轉化生長因子(TGF)-β1/Smad和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑改善高血壓鼠模型中的腎損害和炎癥反應。本課題組的研究亦發現，替米沙坦能降低高鹽飲食大鼠腎皮質TGF-β1/Smads信號通路的基因和蛋白表達〔20〕。本實驗結果提示，替米沙坦對長期高鹽飲食飼養Wistar大鼠的腎保護作用可能與降低尿蛋白、減輕炎性反應有關。

綜上所述，長期高鹽飲食飼養導致Wistar大鼠的腎損害與炎癥和氧化應激有關，PPAR-γ蛋白表達的增高可能對其有拮抗作用，替米沙坦可能通過降低尿蛋白的排泄和抑制炎癥反應對腎臟起保護作用。

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〔2014-07-15修回〕

(編輯 郭 菁)

國家自然科學基金資助項目(No.81160041)；貴州省社會發展攻關計劃項目和省高層次人才科研條件特助項目〔黔科合SY字(2011)3047號，TZJF-2009年-42〕

商黔惠(1960-)，女，教授，主要從事高血壓及其靶器官損害的研究。

王曉春(1982-)，女，主治醫師，主要從事高血壓及其靶器官損害的研究。

R544.1

A

1005-9202(2015)12-3213-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.012