光敏湯對HaCaT細胞表達IL-10影響研究

王麗新

（寧夏醫科大學高等衛生職業技術學院基礎醫學教研室，寧夏 銀川 750004）

近年來由于環境污染的日益加劇，平流層臭氧消耗的增加，到達地球表面的紫外線（UV）增多，已成為影響人類健康最重要的環境因素之一。許多皮膚疾病的發生與UV損傷有著密切關系，如光老化、多形性日光疹、紅斑狼瘡、皮膚腫瘤等。

IL-10是紫外線引起光損傷的重要細胞因子，UV照射后1L-10產生增多，主要來自于角質形成細胞（KC）、黑素細胞和浸潤表皮的巨噬細胞，具有較強的抗炎及免疫抑制活性。我們制備不同的動物含藥血清作用于經過紫外線照射后的HaCaT細胞，以檢測不同動物含藥血清對HaCaT細胞分泌IL-10的影響，從而探討其治療機制。

1 實驗材料

細胞：人永生化角質形成細胞HaCaT細胞株，購自百奧邁科生物技術有限公司。

實驗動物：SD大鼠30只，雌雄各半，體質量250～350g，由寧夏醫科大學動物實驗中心提供。

儀器設備：超凈工作臺、全波長酶標儀、紫外可見光分光光度計、紫外線光療儀、二氧化碳孵箱、超速低溫離心機、6孔培養板。

試劑：DMEM/F12培養基、無噬菌體胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、人IL-10ELISA檢測試劑盒、EDTA。

藥物：實驗所用藥物均購自銀川市中醫院藥劑科。甲氨蝶呤片（MTX）（上海信誼藥廠有限公司生產，國藥準字H31020644）。光敏湯Ⅰ號藥用白茅根20g，生石膏20g，生地15g，丹皮15g，紫草9g，金銀花12g，連翹12g，大青葉15g，藿香10g，佩蘭10g，薏苡仁15g，滑石9g，車前子12g，竹葉6g，烏梅10g，防風10g[1，2]。光敏湯Ⅱ號為在光敏湯Ⅰ號基礎上加黃芪12g，枸杞子12g，甘草9g。

2 實驗方法

中藥提取液的制備：由寧夏醫科大學藥理實驗室加工完成。分別稱取光敏湯Ⅰ號中藥材1200g，光敏湯Ⅱ號中藥材1398g（為成人6天的劑量），加6倍的雙蒸水浸泡2h，密閉，中火煎煮1h，濾出藥液，藥渣再加雙蒸水4倍，煎煮0.5h，濾出藥液，合并2次藥液，取上清液，于60℃水浴分別濃縮至400mL（每毫升藥液分別含3g、3.5g生藥）。

動物血清藥配制：取30只SD大鼠隨機分為光敏湯Ⅰ號組、光敏湯Ⅱ號組、甲氨蝶呤（MTX）陽性對照組、UVB陽性對照組及空白對照組，每組6只。2個中藥組分別給予相應的中藥提取液灌胃（按照人和動物體表面積折算成人2倍的劑量），用量為16mL/（kg·d）；甲氨蝶呤（MTX）陽性對照組以蒸餾水溶解液灌胃，用量為0.4mg（16mL）/（kg·d）；UVB陽性對照組及空白對照組給予等體積蒸餾水灌胃。每日分2次灌飼，連續5天，在最后1次給藥2h后取腹主動脈采血（無菌操作），分離血清，56℃滅活30min后分裝，-20℃凍存備用。

細胞接種：將HaCaT細胞凍存管從冷凍箱中取出后立即置于37℃水浴中，輕輕晃動凍存管，解凍細胞。然后將細胞懸液轉移至裝有10mLMEM培養液的離心管中，用吸管吹打使細胞均勻懸浮。將離心管放入離心機中，20℃，1000轉/min，離心5min，棄上清液，加入MEM完全培養液，用吸管吹打均勻后進行細胞計數，并將細胞密度調整為5×105個/mL。再將細胞懸液轉移至細胞培養瓶中，每瓶3mL細胞懸液，將其置于37℃，5%CO2的孵育箱中培養，次日更換培養液后繼續培養，待細胞貼壁后進行實驗。準備8個6孔板（分別供6、12、24、48h檢測使用），取培養瓶內亞融合狀態、對數期生長的HaCaT細胞，用0.25%胰蛋白酶加0.02%EDTA消化后制成單細胞懸液，使用細胞計數板計數后用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基調整細胞密度至1×105個/mL，轉種至6孔細胞培養板，每孔3mL。

HaCaT細胞實驗分組：將接種至6孔板的細胞分為5組，光敏湯Ⅰ號組、光敏湯Ⅱ號組、甲氨蝶呤（MTX）陽性對照組、UVB陽性對照組及空白對照組。待HaCaT細胞完全貼壁后，棄掉培養液，實驗組分別加入相應濃度的動物血清培養24h；空白對照組及UVB陽性對照組加入蒸餾水動物血清培養基培養24h。

紫外線照射：加藥培養24h后吸棄各孔培養液，PBS洗滌2遍，并用少量PBS覆蓋細胞，以30mJ/cm2劑量的UVB照射，照射距離15cm。照射時將空白對照組用無菌錫紙覆蓋，并將6孔板置于水浴中接受照射，以防產熱。照射完畢吸出PBS，空白對照組及UVB對照組每孔加入DMEM/F12培養液3mL，實驗組各孔加入相應濃度的溶液3mL繼續培養。

收集細胞及培養上清液：6h、12h、24h、48h后，用Eppendof管收集細胞培養上清液， 每管收集500μL，-20℃保存。待所有標本收集完后采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測上清液中IL-10的表達。

用SPSS17.0統計軟件分析，計量資料用（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析進行檢驗，對各組間的總的比較差別有統計學意義的進一步用LSD法做兩兩比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

各組HaCaT細胞表達IL-10的水平比較見表1。空白對照組12h、24h、48h、72h后，上清液中IL-10的濃度為35～39 pg/mL，UVB陽性對照組IL-10為48～71 pg/mL，組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。與UVB陽性對照組比較，藥物治療組在UVB照射后12h、24h、48h、72h，IL-10的分泌量都有所下降，在紫外線照射24h后，光敏湯Ⅰ、Ⅱ號組與UVB陽性對照組分泌的IL-10有顯著統計學差異（P＜0.05）；UVB照射48h后，光敏湯Ⅰ、Ⅱ號組、甲氨蝶呤（MTX）陽性對照組與UVB陽性對照組分泌的IL-10比較差異有統計學意義（P＜0.05）；UVB照射后72h，光敏湯Ⅰ、Ⅱ號組與UVB陽性對照組分泌的IL-10比較差異有統計學意義（P＜0.05）；光敏湯Ⅱ號組UVB照射后72h，與甲氨蝶呤（MTX）陽性對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；光敏湯Ⅰ號組與甲氨蝶呤（MTX）組在各個時段分泌的IL-10含量比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組HaCaT細胞表達IL-10的水平比較 （pg/mL，±s）

表1 各組HaCaT細胞表達IL-10的水平比較 （pg/mL，±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與UVB陽性對照組比較，#P＜0.05；與MTX陽性對照組比較，△P＜0.05。

組別 12h 24h 48h 72h光敏湯Ⅰ號組 45.74±10.61* 49.32±12.12*# 60.21±13.23*# 58.65±11.24*#光敏湯Ⅱ號組 43.85±12.34 47.47±9.15*# 58.46±7.37*# 47.87±13.33*#△MTX陽性對照組 45.56±8.36* 50.37±15.95* 61.96±12.84*# 60.97±8.65*UVB陽性對照組 48.86±11.33* 59.34±27.96* 78.35±10.31* 70.67±9.41*空白對照組 35.29±8.37 36.23±9.89 38.32±8.64 38.85±11.31

4 討 論

紫外線是傷害性光線的一種，是引起皮膚損傷的最常見因素，使皮膚松弛，粗糙，萎縮，皺紋加深加粗，色素沉著，毛細血管擴張，癌變等。光老化皮膚在組織學上的變化主要表現為表皮厚度因增生或重度萎縮明顯不均一，表皮與真皮連接變平，真皮炎性細胞浸潤較為多見，彈性纖維增粗、排列紊亂或聚集成團，微血管擴張并扭曲，周圍常有炎性細胞浸潤；黑素細胞灶性增生等[3]。角質形成細胞（KC）位于皮膚的表皮層，是表皮的主要構成細胞，也是中波段紫外線（UVB）作用的靶部位，參與固有免疫應答及皮膚炎癥反應。KC主要是通過釋放細胞因子而間接地影響機體的免疫功能，UV照射可使KC的IL-1、IL-4、IL-6、TNF-α、IL-10等基因表達及分泌增多， IL-15基因表達及分泌減少，導致皮膚免疫抑制[4，5，6]。現代實驗研究證實，人永生化角質形成細胞株（HaCaT細胞）經UVB照射后，IL-10、TNF-α、IL-1β等細胞因子的分泌量明顯增加。

根據中醫辨證論治原則，筆者選取臨床常用的清熱除濕、涼血解毒藥物，組成光敏湯Ⅰ號。方中白茅根清熱解毒、利尿；生石膏清熱生津，止渴，生地、丹皮、紫草入血分，能清熱涼血，金銀花、連翹、大青葉清熱解毒，疏散風熱，善治上焦之風熱邪氣；藿香、佩蘭芳香化濕，內能化濕，外能解表，薏苡仁健脾、利水滲濕，滲利中焦之濕熱邪氣；滑石、車前子利尿通淋，使濕熱之邪從小便而解；竹葉清心利尿，除心煩，小便黃；烏梅酸能斂陰生津，防風既能祛風解表，又能祛風濕，可去除皮膚肌表風濕之邪氣。本方藥物配伍，使上中下三焦各有出路，氣血并治，內外兼顧，祛邪與扶正兼顧。光敏湯Ⅱ號在光敏湯Ⅰ號基礎上加入黃芪、枸杞子、甘草。黃芪補氣，能夠增強機體對外界刺激的抵抗力，枸杞養肝滋陰，兩藥與清熱除濕、涼血藥配伍使用，既能祛邪，又不傷正。現代藥理實驗證實，枸杞子的有效成分枸杞多糖具有抗紫外線，提高免疫力的作用[7]；而黃芪總苷也被證實具有抗皮膚衰老，抗氧[8]；甘草補氣、調和諸藥，同時具有抗炎、類激素樣作用[9]，是治療日光性皮炎的常用藥物。

從光敏湯對HaCaT細胞分泌IL-10的影響角度闡釋光敏湯治療光敏性皮炎的機制，可為進一步的研究奠定基礎。

[1] 匡德芳，谷朝霞.清熱除濕湯治療日光性皮炎15例療效觀察[J].牡丹江醫學院學報，2001，22（3）：66.

[2] 郝秀霞，徐偉.清熱利濕法治療多形性光敏疹[J].內蒙古中醫藥，2003，24（3）：8.

[3] 劉仲榮.皮膚光老化的診斷[J].國外醫學皮膚性病學分冊，2008，26（3）：138-140.

[4] Amerio P，Toto P，Felieiani C，et al.Rethinking the role Of tumour Necrosis factoralpha in ultraviolet（UV）B-induced immunosuppression：altered immune response in UV-irradiated TNFRIR2 genetargeted mutant mice[J].Br J Dermatol，2001，144（5）：952-957.

[5] 李海英.紫外線照射HaCaT細胞起源的細胞因子與Thl/Th2失衡的相關性研究[D].昆明醫學院，2005.

[6] Artukovic M，Ikic M，Kustelega J，et al.Influence of UV radiation on immunological system and occurrence of autoimmune disease[J].Coll Antropol，2010，34：175-178.

[7]李紅光. 枸杞多糖在UVB輻射人角質形成細胞氧化損傷中的保護作用[D].山西醫科大學，2014.

[8]劉曉丹. 黃芪總苷有效成分和三七總皂苷有效成分配伍抗PC12細胞氧化損傷作用的研究[D].湖南中醫藥大學，2012.

[9]陳東波，曾繁濤. 甘草黃酮對紫外線照射無毛小鼠皮膚的防護作用[J].宜春學院學報，2014，36（6）：17-19.