山茱萸總苷干預急性缺氧乳鼠心肌細胞凋亡線粒體通路的研究

陳克芳，李建軍，潘愛珍，侯祥平

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）早期心肌細胞丟失的主要方式為細胞凋亡，凋亡通路的激活決定細胞凋亡的進行，而細胞凋亡通路主要包括半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）信號途徑和不依賴于caspase的兩種信號通路，依賴于caspase的信號途徑主要為線粒體途徑。我們早期的實驗已經(jīng)證實，山茱萸總苷可以抑制急性缺氧時心肌細胞的凋亡［1］，但具體機制尚不清楚，而線粒體的能量耗竭及活性氧的釋放是導致急性心肌梗死時心肌細胞壞死、凋亡的主要病理改變，因此認為山茱萸與線粒體之間必然存在一定的聯(lián)系。本實驗從對心肌細胞凋亡線粒體通路中caspase－9的研究來探明山茱萸總苷抑制心肌細胞凋亡的機制，為開發(fā)治療心肌梗死的天然藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 出生1 d～3 d的SD大鼠，由中山大學實驗動物中心提供。

1.2 試劑 DMEM／F12培養(yǎng)基，吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司產(chǎn)品；DMEM無糖培養(yǎng)基，Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清，Gbico公司產(chǎn)品；0.25%胰蛋白酶，吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司產(chǎn)品；青霉素－鏈霉素溶液，Gibco公司產(chǎn)品；抗α－Sarcomeric actin，武漢博士德生物有限公司產(chǎn)品；SABC抗caspase－9試劑盒及DAB顯示試劑盒，武漢博士德生物有限公司產(chǎn)品。

1.3 藥物 山茱萸，廣東一方制藥有限公司提供。

1.4 主要儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱，Thermo公司提供。

1.5 方法

1.5.1 山茱萸總苷提取物制備 廣東省中醫(yī)研究所按文獻［2］方法提取，提取物濃縮干燥至粉末狀。

1.5.2 心肌細胞原代培養(yǎng) 將出生1 d～3 d的SD大鼠，用75%酒精消毒后取出心臟，迅速放入4℃預冷D－Hank’s液的培養(yǎng)皿中，洗去心臟表面及血管中的血細胞，剪去心房和大血管。將心臟剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，加入10 mL左右的0.125%胰酶消化液，于37℃水浴箱中分次消化，每次約10 min。收集除第1次以外的細胞懸液于50 mL離心管中，加入含量為10%FBS的DMEM／F12培養(yǎng)液，終止消化。1 000 r／min離心5 min，棄上清，加入含10%FBS的DMEM／F12培養(yǎng)液，輕輕吹打使其形成單細胞懸液，將細胞懸液吸入培養(yǎng)皿中，按差速貼壁法于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，去除成纖維細胞，純化心肌細胞。之后輕輕收集尚未貼壁的細胞懸液，調整細胞密度為1×105／mL～5×105／mL，接種于6孔培養(yǎng)板中。細胞于37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，每2 d換一次液，培養(yǎng)3 d～4 d后使用［3］。

1.5.3 實驗分組 缺氧模型組：正常培養(yǎng)3 d的心肌細胞棄去培養(yǎng)液，換成無糖DMEM液，用無菌液狀石蠟封住液體表面，使細胞缺氧［4］。對照組：心肌細胞不做任何處理，正常條件培養(yǎng)。山茱萸總苷干預組：細胞缺氧處理之前24 h在培養(yǎng)液中加入0.49 g／L的山茱萸總苷，缺氧培養(yǎng)的同時加入0.49 g／L的山茱萸總苷進行干預。各組設1 h、2 h、3 h、5 h 4個時間點進行指標觀察。

1.5.4 心肌細胞的鑒定 按照SABC抗a－橫紋肌肌動蛋白試劑盒說明方法：將培養(yǎng)3 d的細胞爬片用4%的多聚甲醛固定30 min，然后用30%H2O21份＋純甲醇50份混合液室溫浸泡30 min后蒸餾水洗1次～2次，滴加5%BSA封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，滴加1∶100稀釋的一抗（小鼠抗大鼠α－Sarcomeric actin），對照組用蒸餾水代替一抗，37℃孵育1 h，PBS洗2 min×3次。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，室溫20 min，PBS洗2 min×3次。滴加試劑SABC，37℃20 min，PBS洗5 min×4次。二甲苯透明，中性樹膠封片［5］。

1.5.5 SABC法檢測心肌細胞caspase－9的表達 培養(yǎng)的細胞爬片，3 d后棄去培養(yǎng)基，4%的多聚甲醛固定30 min，30%H2O21份＋純甲醇50份混合，室溫浸泡30 min，以滅活內源性過氧化氫酶，蒸餾水洗1次～2次。滴加5%BSA封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，不洗，滴加1∶100稀釋的一抗（小鼠抗大鼠α－Sarcomeric actin），對照組用蒸餾水代替一抗，37℃孵育1 h，PBS洗2 min×3次。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，室溫20 min，PBS洗2 min×3次。滴加試劑SABC，20℃～37℃20 min，PBS洗5 min×4次。DAB顯色：取1 mL蒸餾水，加試劑盒中A、B、C試劑各1滴，混合均勻后加至切片，室溫顯色，鏡下控制反應時間，一般5 min～30 min。蒸餾水洗。蘇木素輕度復染1 min，自來水沖洗。75%、85%、95%、100%梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組比較采用t檢驗，多組數(shù)據(jù)之間的比較采用單因素方差分析，檢驗水平取α＝0.05。

2 結 果

2.1 心肌細胞鑒定 心肌細胞中含有α－Sarcomeric actin，本實驗選用的一抗為小鼠抗大鼠α－橫紋肌肌動蛋白，因此染色后心肌細胞胞漿將被著深棕色，而非心肌細胞則呈陰性染色。心肌細胞的純度鑒定采用每張玻片隨機取10個視野，分別計算出心肌細胞陽性率，重復3次并取平均值為97.260%、96.875%、96.970%，三者取平均值得出心肌細胞的純度為97.035%。

2.2 SABC法檢測心肌細胞caspase－9的表達 與對照組相比，缺氧各組caspase－9的表達增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），并且隨著時間的延長，陽性表達的比例增加，5 h達到最高，給予山茱萸總苷干預之后，治療組每個時間點的caspase－9表達都有所下降，與缺氧組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。詳見表1。

表1 SABC法檢測心肌細胞caspase－9的表達（x±s）

2.3 心肌細胞各組caspase－9表達免疫組化染色情況 實驗發(fā)現(xiàn)，對照組正常心肌細胞陽性著色的細胞很少；隨著缺氧時間延長，陽性著色比例較對照組明顯增多；治療組較缺氧組陽性著色比例明顯減少。

3 討 論

凋亡通路的激活引起細胞凋亡，而細胞凋亡通路主要包括caspase的信號途徑和不依賴于caspase的兩種途徑。具體通路主要有2種：外源性途徑和內源性途徑。①外源性途徑［6］：Fas等配體與死亡受體（death receptors）結合，F(xiàn)ADD 聚集，死 亡 效應域（death effector domain，DED）形成，caspase－8活化，下游的caspase－3被激活，最終引起細胞的自動連鎖反應，細胞發(fā)生凋亡。②內源性途徑：在該途徑中，線粒體通路起著主要的作用，長期以來，人們一直忽略了線粒體在細胞凋亡中的作用。但是近年來越來越多的對于線粒體在細胞凋亡中扮演角色的研究發(fā)現(xiàn)，線粒體中含有許多與細胞凋亡相關的酶或蛋白、基因等，并且在細胞凋亡中起著重要的作用，如細胞色素C（Cyt－C）［7］、凋亡誘導因子（apoptosis inducing factor，AIF）等，當各種細胞凋亡信號，如應激、炎癥、缺氧等傳至細胞后，Cyt－C由線粒體進入胞漿，并且結合凋亡蛋白酶活化 因 子 1（apoptotic protease－activating factor－1，Apaf－1），在ATP 或dATP的作用下，通過改變 Apaf－1的分子結構，引起caspase－9的活化，caspase－9活化之后便會激活最重要的凋亡執(zhí)行者caspase－3酶系列，引起細胞凋亡的自動連鎖反應，完成細胞凋亡［8］。

由此可知caspase－9在線粒體凋亡途徑中起著非常重要的作用，其與ATP、凋亡蛋白激活因子－1結合形成凋亡體，激活caspase－3而最終導致細胞的凋亡。因此抑制caspase－9的表達則可以阻斷casepase－3的激活，最終達到阻止細胞凋亡的目的。以上的實驗證明正常的心肌細胞caspase－9幾乎沒有表達，而缺氧、缺血則可以引起心肌細胞的凋亡，并且隨著時間的延長，caspase－9陽性表達細胞比例明顯增多，表明其參與細胞凋亡的過程。每組給予山茱萸總苷0.49 g／L干預后，缺氧處理組的caspase－9陽性表達下降，差異有統(tǒng)計學意義。這表明山茱萸總苷可以抑制caspase－9的表達，通過阻斷心肌細胞凋亡線粒體信號通路而抑制心肌細胞的凋亡，起到保護心肌細胞的作用。

［1］ 陳克芳，李建軍，潘愛珍，等.山茱萸總苷干預急性缺氧乳鼠心肌細胞凋亡的研究［J］.中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2012，10（12）：1488－1489.

［2］ 吳紅，梁恒，劉永紅，等.山茱萸總皂苷的提取分離與含量測定［J］.第四軍醫(yī)大學學報，2003，24（5）：430－431.

［3］ 辛毅，許秀芳，黃益民.乳小鼠心肌成纖維細胞和心肌細胞的分離培養(yǎng)及熒光鑒定［J］.新鄉(xiāng)醫(yī)學院學報，2011，28（5）：541－547.

［4］ 曾文靜，劉菊英，柯昌斌.液體石蠟封閉法建立大鼠心肌細胞缺氧／復氧損傷模型［J］.鄖陽醫(yī)學院學報，2010，29（2）：108－110.

［5］ 張乃菊，陳天平，祝曉光.乳鼠心肌細胞和心臟成纖維細胞的原代培養(yǎng)［J］.蚌埠醫(yī)學院學報，2010，35（6）：558－561.

［6］ 張玉清，王宇彬，宋書凱.Fas系統(tǒng)誘導細胞凋亡與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的研究進展［J］.國際內科學雜志，2008，35（4）：205－207.

［7］ 楊澤棟，李永東.細胞色素C評價心肌細胞凋亡的研究進展［J］.醫(yī)學綜述，2012，18（3）：341－343.

［8］ Youle RJ，Strasser A.The Bcl－2 protein family：Opposing activities that mediate cell death［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2008，9（1）：47－59.