龜靈海馬湯劑對老年大鼠心肌梗死所致早搏和細(xì)胞免疫的影響

張?jiān)螺x，魏陵博，陳 艷，張 燁

心律失常是急性心肌梗死急性期死亡的重要原因，即使及時(shí)開通罪犯血管，缺血再灌注也會(huì)誘發(fā)心律失常，但是心律失常抑制試驗(yàn)（CAST）發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用Ⅰ類抗心律失常藥物后室性心律失常減少，但死亡率卻明顯上升。本研究應(yīng)用龜靈海馬湯劑干預(yù)老年大鼠實(shí)驗(yàn)性心肌梗死所致心律失常，觀察龜靈海馬湯劑對實(shí)驗(yàn)性心肌梗死老年大鼠早搏和細(xì)胞免疫的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 25月齡Wistar大鼠（和60歲的人年齡大致相當(dāng)）48只，雄性，體重500 g±50 g，由山東大學(xué)新藥評價(jià)中心提供。

1.2 藥物 ①垂體后葉素每支10 U，由上海第一生化藥業(yè)公司及上海生物化學(xué)制藥廠聯(lián)合生產(chǎn)；②穩(wěn)心顆粒由山東步長制藥有限公司生產(chǎn)（黨參、黃精、三七、琥珀、甘松），每包9 g，60 kg成年人1 d劑量為27 g，相當(dāng)于成人劑量0.45 g／kg；③龜靈海馬湯劑（龜板12 g、靈芝15 g、海馬9 g，為60 kg成年人1 d劑量，相當(dāng)于成人劑量0.6 g／kg）由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室提供；④戊巴比妥鈉由上?；瘜W(xué)試劑廠進(jìn)口分裝。⑤CD4 ELISA試劑盒、CD8 ELISA試劑盒，由上海信帆生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 儀器 ①心電圖機(jī)，由美國Burdick公司生產(chǎn)。②流式細(xì)胞儀，型號 TMB4－Accuri c6，LDZ4－0.8型低速自動(dòng)平衡微型離心機(jī)（北京醫(yī)用儀器廠），精密移液器，F(xiàn)A1104電子分析天平（上海天平儀器廠），XW－80A渦旋混合器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）、DZKW－C型電子恒溫水浴鍋（黃驊市御甲綜合電器廠），80－2離心沉淀器（上海手術(shù)器械廠）等。

1.4 方法 將48只大鼠隨機(jī)分為4組：龜靈海馬湯劑高劑量組（0.9 g生藥／mL）、龜靈海馬湯劑低劑量組（0.6 g生藥／mL）、模型對照組、穩(wěn)心顆粒組（0.45 g／mL），每組12只。龜靈海馬湯劑高劑量組每天龜靈海馬湯劑9 g／kg灌胃，龜靈海馬湯劑低劑量組每天龜靈海馬湯劑6 g／kg灌胃，分別相當(dāng)于60 kg成年人1 d劑量的15倍和10倍；穩(wěn)心顆粒組按4.5 g／kg灌胃，相當(dāng)于60 kg成年人1 d劑量的10倍，灌胃容積1 mL／100 g體重，模型對照組使用等體積蒸餾水。連續(xù)給藥4周。末次給藥后1 h稱重標(biāo)記，以2%濃度配制戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉動(dòng)物，劑量為4 mL／kg，背位固定，將金屬針電極插入大鼠四肢末端皮下，并連接心電圖機(jī)，做正常心電圖，然后將垂體后葉素注射液10 U／支（2 mL）用生理鹽水配成2 U／mL，按照0.5 U／kg劑量經(jīng)舌下靜脈于10 s內(nèi)推完，觀察心電圖變化，記錄早搏出現(xiàn)時(shí)間、持續(xù)時(shí)間。將做完心電圖的大鼠經(jīng)腹主動(dòng)脈取全血8 mL，其中6 mL放入一試管中分離血清，另外2 mL加入EP管（已編號），用力搖晃EP管，取FITC（異硫氰酸熒光素，fluorescein isothiocyanate）CD4＋10μL滴入各EP管。取FITC CD8＋10μL滴入各EP管中，均勻混合，靜置15 min。各EP管加入溶紅細(xì)胞，混勻，室溫靜置12 min后，低速離心5 min，棄上清，加入磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffer saline，PBS）0.5 min后重見細(xì)胞，過300目篩網(wǎng)，上流式細(xì)胞儀測得CD4＋，CD8＋。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物完成實(shí)驗(yàn)情況 模型對照組造模時(shí)死亡3只；穩(wěn)心顆粒組造模時(shí)死亡1只，動(dòng)物本身有心律失常1只，灌胃期間死亡1只；龜靈海馬湯劑低劑量組造模時(shí)死亡1只，動(dòng)物本身有心律失常1只，注射不成功1只；龜靈海馬湯劑高劑量組造模時(shí)死亡1只，動(dòng)物本身有心律失常1只，注射不成功1只。

2.2 龜靈海馬湯劑抗老年大鼠心肌梗死所致早搏作用 龜靈海馬湯劑高劑量組大鼠心律失常開始出現(xiàn)時(shí)間最長，而持續(xù)時(shí)間最短，明顯優(yōu)于其他3組；穩(wěn)心顆粒組和龜靈海馬湯劑低劑量組優(yōu)于模型組。詳見表1。

表1 各組大鼠急性心肌梗死所致心律失常開始出現(xiàn)和持續(xù)的時(shí)間比較（x±s） s

2.3 龜靈海馬湯劑對老年大鼠急性心肌梗死的保護(hù)作用 穩(wěn)心顆粒組、龜靈海馬湯劑高劑量組、龜靈海馬湯劑低劑量組升高T波高度均優(yōu)于模型組；龜靈海馬湯劑高劑量組、穩(wěn)心顆粒組減輕ST段下移程度均優(yōu)于模型組，以高劑量組療效最為顯著。詳見表2。

表2 各組大鼠急性心肌梗死T波高度和ST段下移程度的比較（x±s） mV

2.4 龜靈海馬湯劑對老年急性心肌梗死大鼠免疫功能的影響 龜靈海馬湯劑高劑量組CD4＋含量和CD4＋／CD8＋高于其他3組，CD8＋含量低于模型組。詳見表3。

表3 龜靈海馬湯劑對急性心肌梗死大鼠CD4＋和CD8＋的影響（x±s）

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化（AS）斑塊的不穩(wěn)定是由炎癥增強(qiáng)所致，是非特異性和特異性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)誘發(fā)血管損傷的結(jié)果［1］。吳瓊等［2］研究發(fā)現(xiàn)CD4＋T細(xì)胞參與了心肌的缺血再灌注損傷，在壞死心肌組織中出現(xiàn)了較多的CD4＋T的浸潤。Vallejo［3，4］提出晚期AS等慢性疾病臨床并發(fā)癥的主要免疫病理機(jī)制，認(rèn)為機(jī)體針對慢性抗原的持續(xù)免疫導(dǎo)致了免疫系統(tǒng)的衰老和重構(gòu)，特別是T淋巴細(xì)胞克隆組成發(fā)生改變以及衰老的T淋巴細(xì)胞功能出現(xiàn)多樣性，這些衰老的T淋巴細(xì)胞新生表達(dá)天然殺傷細(xì)胞受體（NKRs）和殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體（KIRs）等細(xì)胞表面分子，并介導(dǎo)了組織器官的免疫損傷，引起機(jī)體內(nèi)炎癥反應(yīng)顯著增強(qiáng)，導(dǎo)致急性冠脈綜合征（ACS）的發(fā)生。

老年有免疫力降低而心血管事件顯著增加的特點(diǎn)，本研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎活血方藥具有抗心肌缺血所致的早搏和改善免疫的功效，用龜靈海馬湯劑干預(yù)急性心肌梗死模型老年大鼠，發(fā)現(xiàn)龜靈海馬湯劑組比模型組大鼠心電圖早搏開始出現(xiàn)的時(shí)間延長而持續(xù)時(shí)間縮短，T波高度較高，ST段下降程度減小，體現(xiàn)了抗心肌缺血和抗心律失常作用，而且高劑量組的作用優(yōu)于穩(wěn)心顆粒和龜靈海馬湯劑低劑量組。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)龜靈海馬湯劑高劑量組有使T細(xì)胞亞群的CD4＋亞群增加，CD8＋亞群下降的效應(yīng)，CD4＋分子表達(dá)于輔助性及（或）誘導(dǎo)T細(xì)胞（TH／TI）表面，CD8＋分子表達(dá)于抑制、殺傷性T細(xì)胞（TS／TC）表面［5］，其中TH／TI較為重要，占T細(xì)胞總數(shù)6 0%左右，起到調(diào)節(jié)免疫作用，而TS／TC有抑制免疫和殺傷攜帶抗原的靶細(xì)胞功能，說明高劑量的龜靈海馬湯劑具有調(diào)節(jié)老年大鼠的細(xì)胞免疫功能作用。

本方龜板填精益髓為君，靈芝補(bǔ)心氣為臣，海馬補(bǔ)腎壯陽活血為佐，與龜板配合陰陽雙補(bǔ)，又可輔助靈芝活血安神。藥理研究表明，龜甲的煎煮濃縮液可使整體耗氧量降低、痛閾延長、心率減慢等抗陰虛的效應(yīng)［6］，靈芝既有免疫增強(qiáng)和免疫恢復(fù)作用，又有抗變態(tài)反應(yīng)的作用，對機(jī)體的免疫狀態(tài)起著雙向調(diào)節(jié)作用［7］。海馬的水、醇提取物具有促進(jìn)小鼠免疫功能和抗應(yīng)激的作用，可增強(qiáng)抗高溫、耐缺氧能力，增加小鼠的脾重，提高碳粒廓清率和吞噬指數(shù)［8］，海馬具有明顯的抗血栓藥理作用，能明顯抑制大鼠實(shí)驗(yàn)性頸動(dòng)脈血栓和大鼠腦血栓的形成［9］。因此龜靈海馬湯劑對老年大鼠心肌梗死導(dǎo)致的早搏有治療作用，而且可以調(diào)節(jié)其細(xì)胞免疫。

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