CD4＋CD25＋調節性T細胞對ox－LDL誘導的小鼠巨噬細胞焦亡的影響

林 靜，酉鵬華，程 功，王 毅，陳海潮，楊 征，郭 敏

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種慢性炎癥性疾病［1］。CD4＋CD25＋調節性T細胞（regulatory T cell，Treg）是一類具有負向調節功能的T細胞亞群。研究證實，Treg具有抗AS作用。AS患者循環與AS模型動物Treg數量顯著減少，功能明顯受損［2］；體內誘導和過繼轉輸Treg均可明顯抑制apoE－／－小鼠動脈粥樣硬化斑塊的發生［3，4］。進一步研究證實Treg抗AS的機制與其內皮保護及抗巨噬細胞泡沫化有關［5，6］，但是Treg是否對AS斑塊細胞死亡有影響目前尚無研究。本實驗以小鼠巨噬細胞為研究對象，觀察Treg對小鼠巨噬細胞死亡的影響，并對其可能機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 C57B小鼠，SPF級，購自中國科學院上海實驗動物中心，雌雄不限，8周～12周齡。

1.2 主要試劑 淋巴細胞分離液購自上海試劑二廠。小鼠CD4＋CD25＋T細胞磁珠分離試劑盒，MiDiMACS、分選器，LD和MS分選柱購自德國Miltenyi Biotec公司；抗小鼠CD3單克隆抗體為BD Pharmingen公司產品；RPMI1640及胎牛血清為Gibco公司產品。Cyto－Tox 96細胞毒性檢測試劑盒購自Promega公司。TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自Roche公司。Calcein／EthDⅢ染色試劑盒購自Biotium公司。小鼠白細胞介素 （IL）－18、IL－β1ELISA 試 劑 盒 購 自 eBiosience 公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞分離與培養

1.3.1.1 CD4＋CD25＋T細胞及CD4＋CD25－T細胞的分離 斷頸處死小鼠，取脾臟，Ficoll分離獲得單個核細胞；通過小鼠CD4＋T細胞磁珠分離試劑盒，陰性選擇獲得CD4＋T細胞；加入PE標記抗小鼠CD25單克隆抗體，再加入磁珠標記抗PE，陽性選擇獲得CD4＋CD25＋T細胞，陰性選擇獲得CD4＋CD25－T細胞，通過流式細胞儀（BD FACS Calibur）分析細胞純度。

1.3.1.2 巨噬細胞的分離 斷頸處死小鼠，75%乙醇浸泡10 min，剖腹收集腹腔內液，800 r／min離心5 min后收集細胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液調整細胞濃度至1×106／mL，加入培養板中，置5%CO2、37℃孵箱培養4 h后去上清液，用PBS洗去未貼壁細胞。

1.3.2 實驗分組 CD4＋CD25＋T細胞、CD4＋CD25－T細胞（均為5×1 05細胞／孔）與抗小鼠CD3 mAb（5 0 ng／mL）孵育40 h后，分別加入已有貼壁巨噬細胞（3×106／孔～4×106／孔）的培養板，在終濃度均為50 mg／L的氧化型低密度脂蛋白（ox－LDL）共培養48 h，分為4組。對照組：巨噬細胞＋PBS；ox－LDL組：巨噬細胞＋100 mg／L ox－LDL；CD25＋T細胞組（CD25＋組）：巨噬細胞＋CD4＋CD25＋T 細 胞 ＋100 mg／L ox－LDL；CD4＋CD25－T細胞組（CD25－組）：巨噬細胞＋CD4＋CD25－T細胞＋100 mg／L ox－LDL。各組細胞均置5%CO2、37℃孵箱，培養24 h后收獲。

1.3.3 LDH流出檢測 上述各組細胞培養后，收集上清，按照CytoTox 96非放射性細胞毒性檢測試劑盒說明進行操作，于490 nm記錄吸光值并測定乳酸脫氫酶（LDH）含量。

1.3.4 Calcein AM／EthD－Ⅱ細胞活性／毒性檢測 上述各組細胞培養后，去除培養基，清洗2次～3次。加入Calcein－AM／EthD－Ⅲ溶液，37 ℃培養細胞15 min。激光熒光顯微鏡490 nm±10 nm下觀察黃綠色活細胞，然后545 nm再觀察紅色的死細胞。每皿隨機取至少3視野計數，試驗重復3次。細胞死亡率＝紅色計數細胞／綠色計數細胞＋紅色技術細胞×100%。

1.3.5 TUNEL染色 4%多聚甲醛固定細胞。按照TUNEL染色試劑盒說明進行操作。TUNEL陽性率＝綠色計數細胞／藍色計數細胞×100%。

1.3.6 caspase－1 活 性 檢 測 收 集 細 胞，根 據caspase－1試劑盒說明測定各組細胞caspase－1活性。

1.3.7 ELISA檢測細胞因子IL－1β及IL－18濃度 將各組細胞培養結束后，收集培養上清，按照人IL－1β及IL－18試劑盒的操作步驟檢測培養上清中IL－1β及IL－18濃度。實驗設雙復孔，重復3次。

1.4 統計學處理 采用SPSS15.0統計軟件處理。實驗數據以均數±標準差（x±s）表示，根據方差齊性分析的結果，進一步使用S－N－K檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Treg抑制小鼠巨噬細胞表達活化型caspase－1與對照組比較，ox－LDL組巨噬細胞caspase－1活性明 顯 增 加 （P＜0.001）；與 ox－LDL 組 和 CD25－組比較，CD25＋組細胞caspase－1活性顯著性減少（P＜0.001）。詳見圖1。

2.2 Treg抑制ox－LDL誘導巨噬細胞死亡 與對照組比較，ox－LDL組巨噬細胞LDH流出及Calcein－AM／EthD－Ⅲ明顯增加（P＜0.001）；與ox－LDL組和 CD25－組比較，CD25＋組細胞LDH流出及 Calcein－AM／EthD－Ⅲ陽性細胞數量顯著性減少（P＜0.001）。詳見圖2。

圖1 Treg對小鼠巨噬細胞caspase－1活性的影響

圖2 Treg對小鼠巨噬細胞LDH流出及Calcein－AM／EthD－Ⅲ陽性細胞的影響

2.3 Treg抑制ox－LDL誘導的小鼠巨噬細胞TUNEL陽性表達 TUNEL染色表明：與對照組TUNEL陽性細胞 （4.28±0.59）% 比 較，100 μg／mL ox－LDL 組TUNEL陽性細胞（1 6.6 9±1.3 1）%顯著增加（P＜0.05）；與ox－LDL組和 CD25－組（25.53±2.28）%比較，CD25＋組細胞TUNEL陽性細胞（10.02±1.03）%明顯減少（P＜0.01）。

2.4 Treg抑制ox－LDL誘導的小鼠巨噬細胞IL－1β、IL－1 8分泌 與對照組比較，ox－LDL組巨噬細胞IL－1β、IL－18水平明顯增加（P＜0.001）；與ox－LDL組和CD25－組比較，CD25＋組細胞IL－1β、IL－18水平顯著減少（P＜0.001）。詳見表1。

表1 各組IL－1β及IL－18水平比較（x±s） ng／L

3 討 論

細胞焦亡（pyroptosis）是近年來發現并證實的新的細胞死亡方式，其發生依賴于天冬半胱酶－1（caspase－1）激 活，伴 隨IL－1β、IL－18 等 炎 癥 因 子 分泌［7］。焦亡形態學特征表現為細胞膜破裂，細胞內容物釋放以及caspase－1作用于骨架蛋白DNA致使形態學表現為TUNEL陽性。目前研究已證實，焦亡在人類免疫缺陷病毒（HIV）等病原菌及膽固醇結晶等非生物性刺激原介導的細胞死亡中發揮重要作用［7］，但其是否參與AS細胞死亡目前尚無研究。

ox－LDL大量存在于AS斑塊局部，是促AS作用最強的刺激原之一。研究表明ox－LDL可誘導巨噬細胞發生死亡，大多學者認為ox－LDL誘導的巨噬細胞死亡方式為凋亡，其依據為TUNEL染色陽性增加［7］。但是，細胞膜破裂、細胞內容物釋放以及胞內微器官破壞等非凋亡形態學特征同樣可見于ox－LDL誘導的巨噬細胞報道中［8］。盡管有學者提出“凋亡后壞死”，但是體外研究表明給予凋亡關鍵酶阻斷劑及其他凋亡途徑蛋白酶阻斷劑并不能抑制ox－LDL誘導的巨噬細胞死亡［9，10］。上述研究提示細胞其他死亡方式可能參與ox－LDL誘導的巨噬細胞死亡。本研究發現，與對照組比較，ox－LDL組巨噬細胞caspase－1的活性顯著增高，LDH流出及Calcein－AM／EthDⅢ染色陽性細胞顯著增加；TUNEL陽性細胞顯著增高；同時細胞因子檢測IL－1β和IL－18明顯增高。以上結果表明ox－LDL可誘導小鼠巨噬細胞發生焦亡細胞死亡方式，其作用機制尚待進一步研究。

Treg在調控動脈粥樣硬化炎癥反應和發生發展中起重要作用。研究已證實Treg可以抑制ox－LDL誘導的巨噬細胞泡沫化［6，10］，但是 Treg對 ox－LDL誘導巨噬細胞死亡的影響及機制研究甚少。本實驗中，與單獨氧化型低密度脂蛋白刺激比較，與Treg共培養巨噬細胞caspase－1活性明顯受抑制；其細胞死亡也明顯減少，表現為LDH流出減少以及Calcein－AM／EthDⅢ染色陽性數量減少；同時細胞因子檢測表明Treg也可抑制ox－LDL導致的巨噬細胞IL－1β和IL－18分泌，相反，CD4＋CD25－效應性T細胞無上述作用。上述結果提示Treg可抑制氧化型低密度脂蛋白導致的巨噬細胞焦亡，此作用可能是Tregs抗AS機制之一。

綜上所述，本研究證實ox－LDL可誘導小鼠巨噬細胞發生焦亡；Treg可抑制ox－LDL導致的小鼠巨噬細胞焦亡。上述發現不僅有助于進一步明確AS細胞死亡機制，還有助于闡明Treg在AS發生發展的調控作用，而且為AS的防治提供新的干預靶點。

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