局灶性腦缺血大鼠腦組織CD20的表達

夏光明，倪小紅，王洲羿，黃虎翔，肖展翅，劉秋梅，李 鋼

CD20作為跨膜的蛋白質是一種新型鈣通道，CD20的激活是調節內源性鈣離子變化的又一個影響因素，并通過鈣離子變化直接調節鈣離子通道活性。本研究采用大鼠局灶性腦缺血模型，用免疫組化和計算機圖像分析技術檢測局灶性腦缺血CD20的表達情況，初步探討CD20在局灶性缺血腦組織中的變化。

1 材料與方法

1.1 動物及實驗分組 雄性健康SD大鼠28只，體重200 g～250 g，由武漢大學實驗動物中心提供。飼養室內溫度25℃，自由進食。實驗室溫度25℃，實驗前12 h禁食禁水。大鼠隨機分為假手術組及大腦中動脈阻塞（MCAO）后3 h組、6 h組、24 h組。實驗分批進行，每批含各組大鼠7只。

1.2 試劑與儀器 免疫組化試劑盒購自武漢谷歌生物技術有限公司。

1.3 動物模型的制作 大鼠用10%水合氯醛（35 mg／kg）腹腔注射麻醉。仰臥位固定，頸正中線左側旁開約0.5 cm切口，沿胸鎖乳突肌內緣分離肌肉和筋膜，分離左側頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內動脈（ICA），結扎頸外動脈遠心端，用微動脈夾暫時夾閉CCA主干以及ICA入顱部。然后在ECA殘端剪0.3 mm小口，將線拴插入，輕推尼龍線尾端經CCA分叉部沿ICA入顱，遇到阻力，大鼠呼吸心跳加快時停止。尼龍線插入深度從CCA分叉部計18.5 mm±0.5 mm。結扎ECA開口近心端，放開CCA動脈夾，縫合傷口，單籠飼養觀察。參考Longa等［1］的方法進行動物清醒后爬行行為障礙評分：無神經功能缺失癥狀，活動正常者0分；提尾時病灶對側前肢不能完全伸直者1分；爬行時出現向對側轉圈者2分；行走時身體向對側倒者3分；不能自行行走，意識喪失者4分。1分～3分為入組標準。

1.4 免疫組織化學染色 大鼠以10%水合氯醛（35 mg／kg）腹腔注射麻醉。開胸經左心室插管至主動脈，夾閉腹主動脈。依次灌注生理鹽水250 mL，4%多聚甲醛PBS緩沖液150 mL。在3 h、6 h和24 h時間點取出全腦，在多聚甲醛中于4℃下固定36 h。常規乙醇梯度脫水透明、石蠟包埋，用切片機自視交叉處向后連續冠狀切片，片厚7μm。按改進的Stermberger PAP法進行CD20免疫組織化學染色，二氨基聯苯胺顯色系統顯色；流水終止反應后蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，清水返藍，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中型樹脂封片觀察。細胞被染成棕褐色為陽性結果。同時做抗體的交叉性試驗及空白對照實驗。

1.5 病理組織觀察 取免疫組化反應陽性切片的相鄰切片作HE染色，進行病理觀察。

1.6 CD20陽性神經元計數 取大腦切片的同一層面梗死灶及其周邊選擇上下左右及中央5個視野，在400倍光鏡下計數CD20陽性神經元的數量，所得陽性細胞數取平均值。

1.7 統計學處理 計量數據用均數±標準差（x±s）表示，組間差異采用t檢驗。

2 結 果

2.1 動物行為特征 手術組動物在麻醉清醒后均呈現局灶性腦缺血表現：右前爪不能前伸，向右旋轉爬行或傾倒。

2.2 HE染色觀察結果 缺血3 h組神經元出現變性；缺血6 h組見皮質、海馬神經元呈空泡變性；缺血24 h組大部分神經元完全壞死，神經元數量減少，殘存神經細胞核變小、顏色深染。

2.3 CD20免疫組化染色 非梗死側無陽性神經元分布。缺血3 h未發現CD20陽性神經細胞；缺血6 h出現CD20陽性神經元，但著色較淡，彌散分布，多數表達于細胞膜，少數同時表達細胞漿中。在梗死灶邊緣與正常腦組織交界處CD20陽性神經元分布有一明顯的分界線。在梗死灶中細胞壞死明顯，CD20表達于細胞漿中。在梗死后6 h和24 h兩個時間點，CD20陽性神經元的數量變化明顯（P＜0.01）。詳見表1。

表1 梗死灶陽性CD20神經元計數（x±s）

3 討 論

CD20分子為膜結合型蛋白，位于細胞膜上的脂斑區，由297個氨基酸組成的非糖基化磷蛋白，4次穿過細胞膜，帶有3個疏水基。分為胞外段、跨膜區和胞內區三部分。胞外區基因長132bp，編碼44個氨基酸［2］。CD20是新型鈣通道，發生交聯甚至超交聯時形成的多聚體發揮鈣通道的功能，使細胞外鈣離子流入細胞內；同時CD20靠近脂斑區Src家族的酪氨酸蛋白激酶并相互激活，啟動信號傳導途徑，動員內源鈣庫。使細胞內鈣超載，進一步導致細胞凋亡［3］。更有研究表明在人早期胚肝內CD20定位于細胞核內，而細胞膜和細胞質呈陰性，但其具體的作用機制仍有待闡明［4］。

CD20在腦梗死患者外周血淋巴細胞中的表達有明顯的升高，而且其表達越高，神經功能缺損越重，提示CD20參與了腦梗死后的炎癥和免疫反應［5］。CD20是否在腦梗死病灶及缺血半暗帶中表達未見有報道，通過免疫組織化學的方法發現CD20在腦梗死病灶及缺血半暗帶中表達顯示出明顯的特征。在梗死灶和缺血半暗帶以外的未缺血腦組織中未見到有CD20的表達，在缺血半暗帶與正常腦組織之間有明顯的分界線；缺血3 h未見到有CD20的表達；缺血6 h發現有CD20的輕度表達，且多數表現為神經細胞膜表達，少數表現為神經細胞胞漿的表達；缺血24 h CD20強烈表達于神經細胞胞漿。根據CD20在缺血后腦組織表達的時空變化特征，推測CD20在缺血6 h左右開始表達，并且初期表達于神經細胞的胞膜，隨著缺血的持續和加重，進一步表現為胞漿表達。腦缺血后遲發性神經細胞壞死發生于缺血后6 h～8 h，其主要的作用機制就是由于缺血過度誘導的細胞凋亡［6］。CD20在腦缺血后的表達處于發生細胞凋亡發生的時期，因此神經細胞CD20表達的作用機制可能與鈣超載和細胞凋亡有關。

［1］ Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20：84－91.

［2］ 洪海燕，舒翠玲，郭燕翔，等.人CD20胞外區基因在原核系統中的表達［J］.免疫學雜志，2000，116（3）：172－174.

［3］ Deans JP，Li H，Polyak MJ.CD20－mediated apoptosis：Signaling through lipid rafts［J］.Immunology，2002，107（2）：176－182.

［4］ 劉影，唐軍民，唐巖，等.人早期胚胎中CD20陽性細胞的免疫組織化學定位［J］.解剖學報，2007，38（2）：238－240.

［5］ 夏光明，鄭雅文，李鋼，等.急性腦梗死患者外周血B淋巴細胞CD19、CD20表達的臨床研究［J］.中國傷殘醫學雜志，2008，16（2）：18－19.

［6］ Arvin KL，Han BH，Du Y，etal.Minocycline markedly protects the neonatal brain against hypoxic－ischemic injury ［J］.Ann Neurol，2002，52（1）：54－61.