人非抗凝血塊中基因組DNA提取不同方法的比較

邱亞，青玉鳳，黨萬太，周京國

(1.川北醫學院附屬醫院醫學研究中心；2.川北醫學院附屬醫院風濕免疫科，四川 南充 637000)

人非抗凝血塊中基因組DNA提取不同方法的比較

邱亞1，青玉鳳2，黨萬太2，周京國2

(1.川北醫學院附屬醫院醫學研究中心；2.川北醫學院附屬醫院風濕免疫科，四川 南充 637000)

目的：比較三種不同方法提取人非抗凝血塊基因組DNA的效果差異。方法：分別采用酚/氯仿法，天根試劑盒，Invitrigen purelinkTM試劑盒提取凍存時間較長的非抗凝血塊基因組DNA，測定濃度、OD260/280值，瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA濃度和純度，測定PCR產物灰度值。結果：三種方法都可以提取出基因組DNA，測定DNA濃度分別為：(35.56±15.27)ng/μL，(45.13±16.54)ng/μL，(57.93±14.5)ng/μL，組間存在統計學差異(P<0.01)，A260/A280值分別為：1.46±0.19，1.49±0.16，1.519±0.23，三組間比較差異無統計學意義(P>0.05)；三種方法提取的基因組DNA都能通過PCR擴增出目的條帶，PCR產物電泳灰度值結果分別為：75.421±3.435，149.32±6.875和229.52±19.55，組間比較差異有統計學意義(P<0.01)。結論：三種不同方法都能提取出凍存時間較長的非抗凝血塊基因組DNA，但Invitrigen purelinkTM試劑盒法效果最好。

基因組DNA；非抗凝血塊；提取；比較

血液基因組DNA作為遺傳信息的載體在臨床檢測，分子生物和遺傳學等領域中具有重要地位，良好的血液基因組DNA為后續的PCR實驗，多態性檢測，基因重組等實驗提供了優質的模板，血液基因組DNA的提取已經成為非常重要的實驗手段。目前常用方法有酚/氯仿法[1]，高鹽沉淀法[2]，固相吸附法[3]，碘化物法[4,5]，主要用于提取新鮮抗凝血高質量基因組DNA。但對于少數凍存時間較長的非抗凝血塊標本，使用常規的方法難以提取到高純度的基因組DNA。因此我們嘗試采用幾種不同的試劑盒和方法提取凍存時間超過兩年的非抗凝血塊基因組DNA，并比較不同方法和不同的試劑盒提取效果的差異，以期建立一種穩定而優質的提取長期凍存非抗凝血塊基因組DNA的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑材料與設備

DNA抽提試劑盒分別購自北京天根公司(0.1～1 mL血凝塊基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)、Invitrigen公司(purelinkTMGenomic DNA mini Kit(50rxn)、紫外分光光度計(biodrosis BD-2000)、BIORAD MyCycler梯度PCR儀、powerpacTMHC電泳儀、61S水平電泳槽(美國BIORAD公司)、Fusion Fx5凝膠成像系統(法國VILBER公司)、Heal Force Neofuge 15R(香港力康生物科技有限公司)。紅細胞裂解液為本實驗室自行配制，配方為10 mmol/L、NaCl、10 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L MgCl2、2×Taq PCR酶購自北京天根生物公司，PCR引物由上海生工合成，HphI限制性內切酶購自NEB公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取凍存血凝塊標本的基因組DNA 將凍存于-80 ℃冰箱中2～4年的非抗凝全血血凝塊100例置于室溫下自然解凍，將重量為2 mm3(相當于全血200 μL)的血凝塊剪碎成0.1 mm3體積大小碎塊，加入PBS浸泡15 min，以玻璃勻漿器勻漿成糊狀，行常規的酚/氯仿法抽提基因組DNA，具體操作為：吸取500 μL勻漿后的血凝塊PBS混合液，加入兩倍體積紅細胞裂解液，混勻，冰浴10 min，4 ℃ 2 500 rpm離心10 min，棄上清，重復一次操作得到白細胞，加入白細胞裂解液(5 mmol/L NaCl,10 mmol/L EDTA,10 mmol/L Tris-HCl)400 μL，10% SDS 160 μL，蛋白酶K 20 μL，56 ℃水浴4 h，加入500 μL酚/氯仿/異戊醇，靜置10 min，4 ℃ 12 000rpm離心10 min，吸取上清至另一干凈EP管，加等體積氯仿混勻,靜置10 min，4 ℃ 12 000rpm離心15 min。取上清至新Ep管，加1/10體積3 mol/L醋酸鈉，2倍體積預冷無水乙醇冰浴3 min，4 ℃12 000 rpm離心5 min，沉淀用預冷70%乙醇洗滌控干后，加入50 μL TE液溶解沉淀。

與前述同樣的方法剪碎血凝塊，加入1 mL紅細胞裂解液立即勻漿，然后分別以天根血凝塊基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)和Invitrigen purelinkTM血液基因組DNA提取試劑盒提取血凝塊基因組DNA，操作步驟見試劑盒說明書。

1.2.2 基因組DNA的鑒定 ①用超微量紫外分光光度計檢測各提取方法得到的DNA在波長為260 nm和280 nm的A260和A280吸光度值和濃度，DNA純度以A260/A280值為依據。②瓊脂糖凝膠電泳：取5μL不同方法提取到的DNA行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100 V，30 min后觀察結果。③PCR擴增：以我們正在研究的低氧誘導因子1α(HIF-1α)基因的一個功能SNP rs11549465序列為模板設計引物，引物序列為上游5’-GCTGAAGACACAGAAGCAAAGAA-3’下游5’-GTGGCATTAGCAGTAGGTTCTTGT-3’，加入TIANGEN 2×Taq PCR polymerse為PCR反應催化酶，25 μL反應體系，94 ℃預變性1 min，94 ℃ 30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共40個循環，再72 ℃延伸5 min。反應結束取2 μL PCR產物行2.5%瓊脂糖凝膠電泳30 min觀察結果并以軟件計算其電泳條帶灰度值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 三種方法提取DNA的濃度和純度的比較

三種方法所提取的血液基因組DNA濃度比較差異具有統計學意義(P<0.01)，而三種方法所測得的DNA純度A260/A280值差異均無統計學意義(P>0.05)。

方法DNA濃度(ng/μL)A260/A280酚/氯仿法35.56±15.27*1.46±0.19北京天根試劑盒提取法45.13±16.54*1.49±0.16InvitrigenpurelinkTM試劑盒提取法57.93±14.5*1.52±0.23

*:酚/氯仿法，北京天根試劑盒提取法，Invitrigen purelinkTM試劑盒提取法分別比較DNA濃度均P<0.01,有顯著性差異，A260/A280比較各組無統計學意義(P>0.05)。

2.2 電泳鑒定

2.5%的瓊脂糖凝膠電泳結果顯示Invitrigen purelinkTM試劑盒提取的DNA條帶明顯比其他兩種方法明亮，拖尾少，酚/氯仿提取的基因組DNA和天根試劑盒提取的DNA的電泳條帶接近(圖1)。

三種方法提取的DNA經過PCR擴增都在350 bp附近出現了條帶，與預期的產物長度351 bp相符，而且通過PCR擴增可以看出Invitrigen purelinkTM血液基因組提取試劑盒提取的DNA PCR產物明顯比北京天根試劑盒和酚/氯仿法提取的DNA PCR產物條帶明亮清晰，北京天根試劑盒提取法得到的DNA PCR產物又比酚/氯仿法提取的DNAPCR產物明亮，這個結果與我們前面的濃度測試結果相符合(圖2)。測得酚-氯仿法，天根試劑盒法和Invitrigen試劑盒法的PCR產物電泳條帶灰度值結果分別為：75.421±3.435，149.32±6.875和229.52±19.55，三組灰度值比較，差異具有統計學意義，均P<0.01。

3 討論

對于臨床上一些不易得到的珍貴血液樣本的保存利用一直是困擾臨床醫生和實驗技術人員的問題，血液樣本經過較長時間的凍存，全血中的核酸及其他有形成分會大大降解，所以一般認為超過兩年的血液樣本就不再適宜提取DNA，造成了臨床樣本的極大浪費。另外對一些未加抗凝劑的干涸的血跡和血塊提取DNA在檢驗醫學、遺傳學、法醫學等領域的應用也是越來越廣泛，怎樣才能利用有限的樣本提取到優良的基因組DNA用于下游的研究是值得我們思考的問題，因此我們嘗試比較幾種不同的方法以找到一種高效的提取方法應用于相關領域。

有研究者發現酚/氯仿法提取凍存血DNA與試劑盒法效果相當[7]，我們的研究卻發現試劑盒法所提DNA濃度總的高于酚-氯仿法，其中Invitrigen purelinkTMGenomic DNA Kit試劑盒法最高，這可能不僅因為試劑盒本身提取效率較高，還與對血凝塊的處理方法不同有關。在本研究中，酚/氯仿法加入PBS勻漿血凝塊標本，而試劑盒法采用紅細胞裂解液勻漿樣本。紅細胞裂解液作為高鹽溶液在提取核酸中的作用是造成紅細胞膜內外離子濃度差異產生較大滲透壓而使紅細胞溶脹破裂，因此直接使用紅細胞裂解液勻漿的操作使紅細胞裂解更充分，清除了紅細胞碎片以后的白細胞中的DNA更容易釋放[7]，這種方法比加入PBS勻漿以后再加入紅細胞裂解液的方法DNA得率更高。

本研究的PCR結果也證實Invitrigen purelinkTMGenomic DNA Kit試劑盒提取的DNA作為模板是優于其他兩種方法的，Invitrigen purelinkTMGenomic DNA Kit試劑盒是一種高通量多用途的DNA提取試劑盒，可以從細胞、組織、細菌、血液、唾液等多種來源樣本直接提取DNA，其本質是一種高鹽沉淀法，并且采用高質量蛋白酶K將所有蛋白降解成為肽鏈或小片段的氨基酸使DNA分子完整地被分離出來[8]，然后采用高鹽沉淀蛋白質并且反復使用硅膠吸附柱純化DNA[9]，最后獲得較高濃度和質量的DNA,70%乙醇洗滌也降低了DNA中鹽的濃度,充分保證后期的PCR，Southern印跡雜交等臨床檢測和研究。

我們發現三種方法提取的DNA瓊脂糖電泳結果均有明顯拖尾現象，A260/A280顯示三種提取方法的純度沒有統計學差異，并且均低于1.8，這可能與樣本本身污染較嚴重有關，即使處于-80 ℃低溫環境，樣本的凍存時間過長核酸也會降解，所以在可能的條件下，選擇凍存時間較長的樣本需慎重，最好選用新鮮血液樣本立即完成基因組DNA的提取以保障實驗質量。但是如果因為條件限制確實無法避免地須從陳舊血提取DNA，我們認為可以適當增加紅細胞和白細胞裂解液，蛋白酶K的用量(增加白細胞裂解效率)，并后期純化DNA以達到更好的實驗效果。

總之，酚/氯仿試劑盒法都可以提取出凍存時間較長的非抗凝血凝塊基因組DNA，并且可以滿足PCR、酶切等實驗要求，但是我們也證實試劑盒法提取DNA較傳統的酚/氯仿法得到更滿意的效果，而且Invitrigen試劑盒的提取效果優于天根試劑盒。

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(學術編輯：趙明才)

The comparison of three different methods in extracting genome DNA from human Non-anticoagulant blood clot

QIU Ya1,QING Yu-feng2，DANG Wan-tai2,ZHOU Jing-guo2

(1.MedicalResearchCenter；2.DepartmentofRheumatologyandImmunology,theAffiliatedHospitaltoNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,Sichuan,China)

Objective：To compare three different methods in extracting genomic DNA from human non-anticoagulant blood clot.Methods：The genomic DNA was isolated from long-time cryopreserved human non-anticoagulant blood clots by using the phenol-chloroform methods,TIANGEN kit and Invitrigen purelinkTMkit respectively.The concentration and purity of DNA were measured by ultraviolet spectrophotometer and agarose gel electrophoresis,and PCR experiment was performed using the extracted genome DNA as a template.Results：The genomic DNA was extracted successfully by three methods.The DNA concentration extracted by the three methods were 35.56±15.27 ng/μl，45.13±16.54 ng/μl，57.93±14.5 ng/μl respectively and the statistical significant difference was found among the three different methods in the purity of DNA(P<0.01).However,A260/A280 of the three groups were 1.46±0.19，1.49±0.16，1.519±0.23 and the statistical difference didn’t existed(P>0.05).The target band all appeared after PCR from genomic DNA by three extracting methods and the gray value of three group PCR products was 75.421±3.435，149.32±6.875 and 229.52±19.55 and there was statistical significant difference(P<0.01).Conclusion：The genomic DNA could be extracted from human non-anticoagulant blood clots by three different methods,however,the Invitrigen purelinkTMkit was the best.

Genome DNA;Non-anticoagulant blood clots;Extraction;Comparision

10.3969/j.issn.1005-3697.2015.04.12

四川省衛生廳項目(100160)，南充市科技局項目(14A0032)

2015-03-14

邱亞(1976-)，女，四川南充人，碩士，主治醫師，主要從事風濕免疫性疾病研究。

周京國，E-mail:jgzhou@nsmc.edu.cn

時間：2015-8-4 23∶32 網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20150804.2332.024.html

1005-3697(2015)04-0470-04

R394

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