雙酶法提取黑豆紅色素新工藝

褚盼盼等

摘 要：以黑豆皮為原料、黑豆紅色素提取率為指標，在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗確定雙酶法提取黑豆紅色素的最佳工藝為酶用量（果膠酶+纖維素酶）（2+1） mg、酶解pH值3.6、酶解溫度55 ℃、料液比1∶25、酶解時間120 min、提取2次，提取率高達26.60%。研究結果顯示，采用雙酶法提取黑豆紅色素簡單高效、提取條件溫和且無溶劑殘留問題，適用于食品工業規模化生產。

關鍵詞：黑豆紅色素；提取；纖維素酶；果膠酶

中圖分類號：TS209 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.06.018

Abstract： Taking black soybean skin as the material， and black soybean red pigment extraction rate as index， on the basis of single factor experiment， through orthogonal test the double enzymatic extraction technology was determined. It was as follow enzyme dosage of black soybean red pigment （pectinase and cellulase） 2 mg +1 mg， enzyme solution pH 3.6， enzyme solution temperature of 55 ℃， material liquid ratio 1∶25， 120 min digestion time， extracting 2 times， extraction rate as high as 26.60%.The results showed that the double enzymatic extraction of black soybean red pigment is simple and efficient， has mild extraction conditions and no solvent residue problem， and is suitable to food industry large-scale production.

Key words： black soybean red pigment； extraction； cellulase； pectinase

黑豆紅色素，是一種常見的食品添加劑，其著色自然，同時具有一些生理功能如抗氧化、抗肥胖、延緩衰老、保護肝臟、降血脂[1]等。目前，黑豆紅色素的提取主要采取的是一些傳統的方法如溶劑提取法[2-8]、超聲波輔助提取法[9-10]、微波輔助提取法等[11]，色素提取率僅18%左右。提取的過程中不僅存在著提取時間長、熱敏性組分易被破壞等問題，而且還有生產的色素產品純度差、提取率低、存在異味和溶劑殘留等缺點[12]，嚴重制約了黑豆紅色素在食品工業的綜合利用。鑒于黑豆紅色素有著重要的藥理作用，近年來不少學者對黑豆紅色素的提取方法進行了很多的研究探索，但主要還是集中在對傳統方法的優化或改良上。

目前，利用酶法提取植物體內活性成分已得到廣泛應用。植物細胞壁的主要成分是纖維素和果膠，植物天然色素往往被包裹在其中而不易溶出。依據此原理，本研究采用纖維素酶和果膠酶兩種酶對黑豆皮進行酶解，破壞其細胞壁骨架結構使其逐級降解，促進導致細胞內色素的溶出，增加黑豆紅色素的提取率[12]，從而實現食品工業規模化生產。目前，國內利用酶法提取黑豆紅色素的研究報道尚少[13]，該研究有助于促進該領域的研究。

1 材料和方法

1.1 材 料

黑豆皮，市售。經清洗、晾干、粉碎后過孔徑為0.25 mm篩制成黑豆皮粉，備用。

1.2 主要試劑與儀器

纖維素酶（2萬U·g-1）：淮安市百麥綠色生物能源有限公司；果膠酶（10萬U·g-1）：江蘇銳陽生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。Neofuge 13R臺式高速冷凍離心機：上海力申科學儀器有限公司；電動攪拌機：杭州儀表電機廠；高速萬能粉碎機，北京化玻聯醫療器械有限公司；SHB-IIIA循環水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 黑豆紅色素的提取工藝流程 黑豆皮粉→酶解提取→抽濾→合并各次濾液→50 ℃減壓濃縮→凍干→黑豆紅色素→計算紅色素提取率

紅色素提取率=（紅色素干質量/黑豆皮干質量）×100%

1.3.2 單因素試驗 分別對影響黑豆紅色素提取效果的單因素如酶用量、酶解pH值、酶解溫度、料液比、酶解時間、提取次數等進行研究。

1.3.3 正交試驗 在單因素試驗的基礎上，對較顯著的4個單因素分別選取3個最優水平，依據L9（34）正交試驗表篩選最優組合以確定雙酶法提取黑豆紅色素的最佳工藝。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 酶用量（果膠酶+纖維素酶）對黑豆紅色素提取率的影響 稱取1 g黑豆皮粉，在酶解pH值為4.6，酶解溫度為45 ℃、料液比1∶20、提取120 min條件下，分別對提取液的不同酶用量（果膠酶+纖維素酶）：1+0、0+1、0.5+0.5、0.5+1、1+0.5、1+1、1+2、1+3、1+4、2+1、2+2、2+3、2+4 mg進行考察，提取1次，稱重后計算紅色素提取率。

由圖1可知，單獨使用果膠酶或纖維素酶的酶解效果均低于混合使用效果，在酶用量為果膠酶（mg）+纖維素酶（mg）為（2+1） mg時紅色素提取率最高。試驗結果表明，在酶用量較高時，紅色素提取率均有不同程度的下降，原因可能是底物濃度不能對酶達到飽和，導致酶的作用受到抑制，導致色素提取率呈下降趨勢[14-16]。

2.1.2 酶解pH值對黑豆紅色素提取率的影響 稱取1 g黑豆皮粉，根據2.1.1結果，選擇紅色素提取率最高的酶用量，在酶解溫度為45 ℃、料液比1∶20、提取120 min條件下，分別對提取液pH 值分別為3.6、4、4.6、5、5.6、6的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液進行考察，提取1次，稱質量后計算紅色素提取率，結果如圖2。

2.1.3 酶解溫度對黑豆紅色素提取率的影響 稱取1 g黑豆皮粉，根據2.1.2結果，選擇紅色素提取率最高的酶用量、酶解pH值，在料液比1∶20、提取120 min條件下，分別對提取液的不同酶解溫度35、40、45、50、55、60 ℃進行考察，提取1次，稱重后計算紅色素提取率。

由圖3可知，從35～55 ℃，隨著酶解溫度的提高，紅色素提取率隨之增加，繼續提高溫度，提取率隨之下降，說明纖維素酶和果膠酶雙酶酶解提取黑豆紅色素最適溫度為55 ℃。

2.1.4 料液比對黑豆紅色素提取率的影響 稱取1 g黑豆皮粉，根據2.1.3結果，選擇紅色素提取率最高的酶用量、酶解pH值、酶解溫度，在提取120 min條件下，分別對提取液的不同料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40進行考察，提取1次，稱重后計算紅色素提取率。

由圖4可知，料液比在1∶25時紅色素提取率為19.14%，達到最高。

2.1.5 酶解時間對黑豆紅色素提取率的影響 稱取1 g黑豆皮粉，根據2.1.4結果，選擇紅色素提取率最高的酶用量、酶解pH值、酶解溫度、料液比，分別對提取液的不同酶解時間60、90、120、150、180、210 min進行考察，提取1次，稱質量后計算紅色素提取率。

由圖5可知，從60～120 min，隨著酶解時間的增加，紅色素提取率隨之提高。如繼續增加酶解時間，提取率無明顯變化，所以確定黑豆紅色素最適酶解時間為120 min。

2.1.6 提取次數對黑豆紅色素提取率的影響 稱取1 g黑豆皮粉，根據2.1.5結果，選擇紅色素提取率最高的酶用量、酶解pH值、酶解溫度、料液比、酶解時間，分別對提取液的不同提取次數1、2、3次進行考察，合并各次濾液，稱質量后計算紅色素提取率。

由圖6可知，隨著提取次數的增加，紅色素提取率隨之提高。但第3次的提取率無明顯增加，從節約能源的角度考慮，確定黑豆紅色素最佳提取次數為2次。

單因素試驗結果表明，黑豆紅色素最佳提取條件為：酶用量（果膠酶+纖維素酶） （2+1）mg、 酶解pH值4、酶解溫度55 ℃、料液比1∶25、酶解時間120 min、提取2次。

2.2 正交試驗結果

在單因素試驗基礎上，對較顯著的因素酶用量、酶解pH值、酶解溫度、料液比等4個因素分別選取3個最優水平，依據L9（34）表安排正交試驗，見表1，得出黑豆紅色素最佳酶解提取條件。

由表2正交試驗結果極差R值大小可知，4個因素對黑豆紅色素的提取率影響為：B（酶解pH值）>A（酶用量）>D（料液比）>C（酶解溫度）。最優提取組合為A2B1C2D3，即酶用量（果膠酶+纖維素酶）（2+1） mg、酶解pH值3.6、酶解溫度55 ℃、料液比1∶25，提取率達26.60%。方差分析表明，以因素C為誤差項，因素A和B對黑豆紅色素提取率的影響差異顯著（P<0.05），因素C和D差異不顯著（P >0.05），與極差分析結果一致。

3 結 論

以黑豆皮為原料，分別對影響黑豆紅色素提取率的單因素如酶用量、酶解pH值、酶解溫度、料液比、酶解時間、提取次數等進行研究。在此基礎上，對較顯著的4個單因素分別選取3個最優水平安排正交試驗，確定雙酶法提取黑豆紅色素最佳條件：酶用量（果膠酶+纖維素酶）（2+1） mg、酶解pH值3.6、酶解溫度55 ℃、料液比1∶25、酶解時間120 min、提取2次，提取率高達26.60%。

在各種黑豆制品如豆油、豆乳、豆粉等的生產過程中，為改善產品風味、防止非酶褐變，并賦予產品良好的色澤等，通常要將黑豆進行脫皮等預處理工序，因此在豆制品的生產過程中會得到大量的副產品，即黑豆皮。我國擁有豐富的黑豆資源，從黑豆制品加工的下腳料黑豆皮中提取天然色素，成本低廉、工藝簡單且易實現工業化，因此具有良好的開發應用前景。試驗結果表明，采用雙酶法提取黑豆紅色素簡單高效、提取條件溫和且無溶劑殘留問題，適用于食品工業規模化生產。

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