液相色譜-電感耦合等離子質譜和電噴霧電離質譜研究乙二胺二氯合鈀與鳥嘌呤脫氧核糖核苷酸反應產物

劉德曄 朱峰 馬永建 吉文亮 劉華良

(江蘇省疾病預防控制中心，南京210009)

1 引言

與Pt(Ⅱ)配合物相同，Pd(Ⅱ)配合物也有殺傷腫瘤細胞作用［1～4］，Pt(Ⅱ)和Pd(Ⅱ)性質相近，采用dsp2 雜化形成平面四邊形配合物，具有高度相似的結構特征。Pt(Ⅱ)配合物殺傷腫瘤細胞的機理是:其與DNA 中的鳥嘌呤脫氧核糖核苷酸5′－dGMP 形成分子鍵，使核酸變性細胞死亡［5，6］;同樣，Pd(Ⅱ)配合物也能使核酸變性［7～10］的細胞死亡。核酸由單核苷酸組成，而5′－dGMP 和5′－GMP(鳥嘌呤核糖核苷酸)是核酸的重要組成，研究Pd(Ⅱ)與5′－dGMP 和5′－GMP 發生分子鍵合原理和方式對Pd(Ⅱ)損傷DNA 以及細胞凋亡機理有理論和現實意義，對開發Pd(Ⅱ)抗癌藥物有指導作用。Zhu 等［11］用電位滴定法和H1NMR 研究了乙二胺二水合Pd［Pd(en)(H2O)2］2+與鳥嘌呤核苷酸5′－GMP 相互作用，認為在pH 5.0 時［Pd(en)(H2O)2］2+與5′－GMP 的N1 位氮形成化合物［Pd(en)(N1－5′－GMP)(H2O)］;在pH ＞8.0 時，4 分子5′－GMP 上N1 和N7 位氮會與4 分子［Pd(en)(H2O)2］2+形成四元環狀化合物［Pd(en)(μ－N1，N7－5′－GMP)］4。Zhang 等［12］通過計算確定了［Pd(en)(H2O)2］2+與鳥嘌呤形成的四元環狀化合物結構。Wirth 等［13］研究了［Pd(en)(H2O)2］2+與5′－GMP 相互作用，認為溶液中除了形成化合物單體和環狀四聚體外還有二聚體。文獻［11，13］均在混合體系中研究產物組成而未對其進行分離檢測具有一定局限性，且文獻所采用的滴定分析法不能直觀定性，產物具有潛在不確定性。色譜和質譜是對復雜體系分離和定性的有力工具，近年來，基于HPLC－ICP－MS 研究食品保健品、水質、生物樣本中元素的形態得到巨大的發展［14～17］，在鉑類抗癌藥物的研究中得到廣泛應用［18～20］，但未見用于Pd 類抗癌藥物的研究。本研究采用HPLC－ICP－MS 聯用分離［Pd(en)Cl2］(結構式見圖1b)與5′－dGMP(結構式見圖1a)反應產物，HPLC－DAD 對產物初步定性，并用ESI－MS 得出主產物分子結構。研究發現，［Pd(en)Cl2］與5′－dGMP反應產物中有兩種能夠在給定色譜條件下流出，且具有相同的紫外吸收光譜，其中主產物經ESI－MS(MS/MS)定性為［Pd(en)(N1－5′－dGMP)］，而另一種產物為它的多聚物，其中［Pd(en)(N1－5′－dGMP)］可大量存在于堿性體系中。研究還發現，在反應體系pH 6.0 時，［Pd(en)Cl2］與5′－dGMP 反應在12 h內完成。本研究建立的基于HPLC－ICP－MS 分離乙二胺二氯合Pd［Pd(en)Cl2］與5′－dGMP 反應產物的方法未見報道，本方法經改進，可用于其它Pd(Ⅱ)抗癌藥物的形態分析。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

ESI－MS 為TSQ QUANTUM ACCESS MAX 串聯質譜儀、X－7 電感耦合等離子體質譜及其工作站(美國，Thermal 公司);色譜與ICP－MS 用Peek 管相連，電子觸發采集數據;OriginPro 7.0 繪圖軟件;LC－20AB 液相色譜儀(日本島津公司)，配備二極管陣列檢測器(DAD)，色譜柱為Acclaim PA2 C18柱(250 mm×4.6 μm，美國戴安公司)。

99%乙二胺二氯合Pd 和鳥嘌呤脫氧核糖核苷酸二鈉鹽(美國Sigma－Aldrich 公司);Na2HPO4、KH2PO4、HCl、NaOH(分析純，南京化學試劑二廠);娃哈哈純凈水(電阻率大于18 MΩ cm)，1000 mg/L Lu 和Pd 單標溶液(美國Spex 公司);HNO3(德國默克公司)。

圖1 5′－dGMP(a)和［Pd(en)Cl2］(b)的結構圖Fig.1 Structure of 5′－deoxyguanyli acid (5′－dGMP)(a)and［Pd(en)Cl2］(b)

2.2 ［Pd(en)Cl2］與5′-dGMP 反應條件

分別稱取4.7 mg(0.02 mmol)［Pd(en)Cl2］和7.8 mg 5′－dGMP 二鈉鹽(0.021 mmol)，混合，用水溶解并定容至10 mL，其中5′－dGMP 略過量，用磷酸鹽緩沖液和NaOH 分別調節至pH 6.0，8.0，9.0 和10.0，在37 ℃水浴中恒溫反應48 h，得到產物的濃溶液，色譜進樣前適當稀釋。

2.3 ICP-MS 和ESI-MS優化的工作參數

本研究選用豐度最高的106Pd(27.33%)作為測定同位素，HPLC－ICP－MS 聯用時基線離子強度小于50 個計數。同心霧化器，霧化室為撞球式霧化室，主要參數經優化后如表1 所示。

利用ESI－MS(MS/MS)研究含Pd 色譜峰的化學結構，需富集色譜流出物至10 mg/L(以Pd 計)以上有較好的響應，且隨著離子源揮發氣溫度和毛細管溫度提高信號響應也對應提高，經優化ESI－MS 的主要參數為:正離子模式，噴霧電壓3000 V，揮發氣溫度450 ℃，毛細管溫度400℃，鞘氣12 L/min，輔助氣3 L/min。

2.4 色譜流出物總Pd與進入色譜柱總Pd比例的測定

因沒有Pd(en)－5′－dGMP1 和Pd(en)－5′－dGMP2 標準物質，無法通過峰面積積分對反應產物進行定量分析，但可通過收集色譜流出物，然后消解得到流出物中總Pd 含量，并與進樣前總Pd 含量進行對比。

將2.2 節中的反應液稀釋至含Pd 4.0 mg/L，色譜進樣50 μL，收集保留時間2.0 ～4.0 min 的色譜流出物共1.6 mL，加入1 mL HNO3－HCl(1∶3，V/V)，密封水浴，100 ℃消解30 min 后冷卻，定容至10 mL，ICP－MS測定。ICP－MS 使用10 μg/L Lu 作為在線內標。

表1 電感耦合等離子體質譜條件Table 1 ICP－MS experimental conditions

3 結果與討論

3.1 HPLC-ICP-MS及HPLC-DAD條件優化

HPLC－ICP－MS 形態分析中常用的流動相緩沖鹽中碳酸鹽和醋酸鹽可能會導致ICP－MS 錐口積碳，所以不采用;而銨鹽可能會與Pd 鹽絡合，也不采用。因此，流動相用磷酸鹽緩沖液配制，高濃度緩沖溶液可使峰型對稱，但易導致ICP－MS 錐口沉積鹽分。實驗表明，最佳條件為:25 mmol/L 磷酸鹽緩沖液作為流動相，流速0.8 mL/min。流動相pH 值影響［Pd(en)Cl2］與5′－dGMP 反應產物的色譜行為，2.2 節中反應產物(pH 6.0)稀釋后，以HPLC－ICP－MS 研究其在不同流動相中行為，結果見圖2。

由圖2a 可見，主產物Pd(en)－5′－dGMP1 峰拖尾覆蓋了另一產物Pd(en)－5′－dGMP2，因此純水不適合作為流動相。由圖2b ～2e 可見，隨著流動相pH值增大，主產物Pd(en)－5′－dGMP1 的拖尾現象消失;pH 8.0 時，主產物保留時間為2.8 min，且Pd(en)－5′－dGMP2 保留時間為3.2 min，峰型良好;雖然pH 9.0 時Pd(en)－5′－dGMP2 峰型更好，但堿性過強，柱壓升高，易損壞色譜柱。因此，本實驗選用25 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)作為流動相，［S3］色譜進樣定量環為50 μL。［Pd(en)Cl2］在此色譜條件下不出峰。

作對應研究的HPLC－DAD 所采用色譜條件與HPLC－ICP－MS 條件相同。DAD 檢測器波長為200 ～350 nm，分辨率1 nm。

3.2 ［Pd(en)Cl2］與5′-dGMP 在不同pH 值下反應產物

按照2.2 節的方法控制體系pH 6.0，8.0，9.0，10.0，反應48 h 后，將溶液稀釋使總Pd 含量為40 μg/L 進HPLC－ICP－MS 分析，結果如圖3 所示。同時，將2.2 節得到的反應液稀釋至含Pd 4.0 mg/L，按照2.4 節方法測定色譜流出的總Pd 和進樣前樣品的總Pd，得出比值。由圖3 可見，隨著反應體系pH 值的增加，Pd(en)－5′－dGMP1 濃度降低，Pd(en)－5′－dGMP2 在pH 6.0 ～9.0 之間濃度上升，但在pH 10.0 時卻降低，說明Pd(en)－5′－GMP1 易在酸性條件下生成，而Pd(en)－5′－dGMP2 易在堿性條件下生成，與文獻［11，13］的研究結果不同，［Pd(en)Cl2］與5′－dGMP在堿性條件下反應產物中始終存在Pd(en)－5′－dGMP1，這是5′－dGMP 比5′－GMP 少一個羥基導致。

圖2 反應稀釋液，以Pd 計含量60 μg/L 的HPLC－ICPMS 圖譜Fig.2 HPLC－ICP－MS chromatogram of reaction diluent(containing 60 μg/L Pd)

由圖3 計算得出，隨著pH 值增大，Pd(en)－5′－dGMP1 與Pd(en)－5′－dGMP2 色譜峰面積之和降低，說明色譜流出的Pd 含量降低。為了定量研究這一過程，用2.4 節方法以ICP－MS 直接測定色譜流出物總Pd 和進樣前總Pd 含量，得出比值分別96%(pH 6.0)、92% (pH 8.0)、81% (pH 9.0)、43%(pH 10.0)。說明隨著pH 值升高，導致體系生成這兩種產物的比例降低。

3.3 反應體系pH 6.0 Pd(en)-5′-dGMP1生成速度研究

由圖4a 和3.1 節得出，在pH 6.0 時，［Pd(en)Cl2］與5′－dGMP 反應產物多為Pd(en)－5′－dGMP1，因此，在此條件下研究Pd(en)－5′－dGMP1 的反應速度較易行，通過測定反應時間和Pd(en)－5′－dGMP1 峰高的關系得出反應完成度(圖4)。由圖4 可見，pH 6.0 條件下反應生成的Pd(en)－5′－dGMP1 在12 h 后即穩定。

3.4 Pd(en)-5′-dGMP1 和Pd(en)-5′-dGMP2定性研究

取pH 9.0 的反應液稀釋至總Pd 含量6.0 mg/L，進HPLC－DAD 研究色譜行為和紫外吸收。

圖3 不同pH 值反應稀釋液中的HPLC－ICP－MS 圖譜(以Pd 計含量40 μg/L)Fig.3 HPLC－ICP－MS chromatogram of reaction diluent with different pH value (containing 40 μg/L Pd)

由圖5 可見，Pd(en)－5′－dGMP1 和Pd(en)－5′－dGMP2 紫外吸收光譜相同，說明這兩種物質由有高度的相似性，再由圖5a 與圖2c 兩種物質峰高比對應說明這兩種產物分子中Pd 百分比相同，進一步印證兩者相似。綜合文獻［11，13］及圖3 和圖5，可推斷Pd(en)－5′－dGMP1 為5′－dGMP 的N1 位氮與［Pd(en)Cl2］按照摩爾比1∶ 1 反應生成的單體［Pd(en)(N1－5′－dGMP)］，而Pd(en)－5′－dGMP2 為Pd(en)－5′－dGMP1 的多聚物。

Pd(en)－5′－dGMP1 分子用ESI－MS(MS/MS)確定。Pd 有5 個同位素，豐度為104Pd(10.97%)、105Pd(22.23%)、106Pd(27.33%)、108Pd(26.71%)和110Pd(11.81%)。因此，在質譜圖中，母離子有特征同位素指紋，如圖6 所示。

圖4 pH 6.0 反應液稀釋后經HPLC－ICP－MS 測得的Pd(en)－5′－dGMP1 時間－峰高圖，稀釋液中總 Pd 200 μg/LFig.4 Peak height－time curve of Pd(en)－5′－dGMP1 under reaction pH 6.0，acquired by HPLC－ICP－MS diluent containing 200 μg/L Pd

圖5 pH 9.0 反應稀釋液以Pd 計含量6 mg/L 的HPLC－DAD 圖譜及Pd(en)－5′－dGMP1、Pd(en)－5′－dGMP2 的紫外吸收光譜(a)HPLC 圖譜，(b)t =2.8 min Pd(en)－5′－dGMP1 紫外吸收光譜，(c)t =3.2 min Pd(en)－5′－dGMP2 紫外吸收光譜，(d)t=7.3 min 游離的5′－dGMP 紫外吸收光譜Fig.5 HPLC－DAD study of Pd(en)－5′－dGMP1 and Pd(en)－5′－dGMP2 under reaction pH 9.0，(a)HPLC chromatography，(b)t=2.8 min Pd(en)－5′－dGMP1 UV spectrum，(c)t =3.2 min Pd(en)－5′－dGMP2 UV spectrum，(d)t=7.3 min 5′－dGMP UV spectrum

圖6 中m/z 510，511，512，514 和516 對應Pd(en)－5′－dGMP1 的［M+1］+碎片，質譜圖豐度比近似對應Pd 同位素豐度比，說明Pd(en)－5′－dGMP1中只含有1 個Pd 原子，證明該分子是單體，驗證了圖4 的推論。對m/z 511，512，514 進行MS/MS 分析，分別得到m/z(315 和152)、(316 和152)、(318和152)的主要碎片。解析Pd(en)－5′－dGMP1 結構，m/z 315，316，318 ［M +1］+碎片及m/z 152［M +1］+碎片如圖7 所示。

由圖7a 可見，Pd(en)－5′－dGMP1 分子結構為［Pd(en)(N1－5′－dGMP)］，其中PO3-4的負電荷和Pd原子的正電荷使分子呈電中性，而原與Pd 連接的Cl(或者水解生成的H2O)在質譜高能過程中丟失。MS/MS 分析時磷酸脫氧核糖從［Pd(en)(N1－5′－dGMP)］分子上解離得到m/z 315，316 和318 的［M+1］+同位素碎片，同位素碎片進一步解離得到鳥嘌呤。圖7b 和圖7c 兩個碎片印證了圖7a 分子結構的正確性。本實驗嘗試對Pd(en)－5′－dGMP2 進行結構定性，但即使富集到150 mg/L 總Pd，也無明顯質譜信號，這可能是由于形成聚合物后所需的離子源揮發氣溫度和毛細管溫度超出儀器允許范圍。

圖6 Pd(en)－5′－dGMP1 的ESI－MS 質譜圖Fig.6 ESI－MS spectrum of Pd(en)－5′－dGMP1

圖7 ESI－MS 得出的Pd(en)－5′－dGMP1 分子結構及其碎片Fig.7 Structure of Pd(en)－5′－dGMP1 and its fragments derived by ESI－MS

1 Puthraya K H，Srivastava T S，Amonkar A J，Chitnis M P.J.Inorg.Biochem.，1985，25:207 －212

2 Tusek－Bozic L，Furlani A，Scarcia V，Clercq E D.J.Inorg.Biochem.，1998，72:201 －210

3 Kuduk－Jaworska J，Puszko A，Kubiak M，Pelczynska M.J.Inorg.Biochem.，2004，98:1447 －1456

4 Hunter T M，Paisey S L，Park H，Cleghorn L，Parkin A，Parsons S，Sadler P J.J.Inorg.Biochem.，2004，98:713 －719

5 Sar D G，Montes－Bayon M，Gonzalez E B，Sierra L M，Aguado L，Comendador M A，Koellensperger G，Hann S，Sanz－Medel A.Anal.Chem.，2009，81(23):9553 －9560

6 Chiavarino B，Crestoni M E，Fornarini S，Scuderi D，Salpin J.J.Am.Chem.Soc.，2013，135:1445 －1455

7 Corduneanu O，Chiorcea－Paquim A，Garnett M，Oliveira－Brett A M.Talanta，2009，77:1843 －1853

8 Vieites M，Smircich P，Pagano M，Otero L，Fischer F L，Terenzi H，Prieto M J，Moreno V，Garat B，Gambino D.J.Inorg.Biochem.，2011，105:1704 －1711

9 Sonmez M，Celebi M，Yardim Y，Senturk Z.Eur.J.Med.Chem.，2010，45:4215 －4220

10 Mukherjee T，Sen B，Zangrando E，Hundal G，Chattopadhyay B，Chattopadhyay P.Inorg.Chim.Acta，2013，406:176 －183

11 Zhu S R，Matilla A，Tercero J M，Vijayaragavan V，Walmsley J A.Inorg.Chim.Acta，2004，357:411 －420

12 Zhang D D，Zhou L X.Comput.Theor.Chem.，2011，967:102 －112

13 Wirth W，Baltronat－Blotevogel，Kleinkes U，Sheldrick W S.Inorg.Chim.Acta，2002，339:14 －26

14 LIU Li－Ping，LV Chao，WANG Ying.Journal of Instrumental Analysis，2010，29(8):767 －771

劉麗萍，呂超，王穎.分析測試學報，2010，29(8):767 －771

15 Nam S H，Oh H J，Min H S，Lee J H.Microchem.J.，2010，95:20 －24

16 JIN Peng－Fei，WU Xue－Jun，ZOU Ding，KUANG Yong－Mei，HU Xin，JIANG Wen－Qing，SUN Chun－Hua.Spectroscopy and Spectral Analysis，2011，31(3):816 －819

金鵬飛，吳學軍，鄒定，鄺詠梅，胡欣，姜文清，孫春華.光譜學與光譜分析，2011，31(3):816 －819

17 Jitaru P，Goenaga－Infante H，Vaslin－Reimann S，Fisicaro P.Anal.Chim.Acta，2010，657:100 －107

18 ZHAO Lei－Chao，WANG Meng，ZHENG Ling－Na，GONG Xin，WANG Bing，FENG Wei－Yue，LIANG Jin－Sheng.Chinese J.Anal Chem.，2012，40(8):1289 －1292

趙磊超，王萌，鄭令娜，宮鋅，汪冰，豐偉悅，梁金生.分析化學，2012，40(8):1289 －1292

19 LIU De－Ye，ZHU Chun，MA Yong－Jian，JI Wen－Liang，LIU Hua－Liang.Chinese Journal of Analysis Laboratory，2012，31(7):75 －79

劉德曄，朱醇，馬永建，吉文亮，劉華良.分析試驗室，2013，31(7):75 －79

20 LIU De－Ye，HAO Yuan－Bin，HAN Wen－Ru，LI Jian，HUO Zong－Li，LIU Hua－Liang.Chinese J.Anal.Chem.，2014，42(11):1667 －1672

劉德曄，郝元斌，韓文儒，李健，霍宗利，劉華良.分析化學，2014，42(11):1667 －1672