鹽酸金霉素分子印跡電化學傳感器的研制

高楊 王偉 劉英姿 陶強 萬雪 張娟琨

(天津市工業微生物重點實驗室，教育部工業微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津300457)

1 引言

金霉素(Chlortetracyline，CTC)屬四環素類光譜抗生素的一種，可由鏈霉菌培養液中提取出或以半合成方法生產，能夠有效抑制革蘭陽性菌、陰性菌、立克次氏體等，抗菌范圍較廣。廣泛應用于魚類、禽畜疾病的預防與治療，添加于飼料中能夠增加禽畜日增重及飼料轉化率。但由于藥物濫用，殘留于動物性食品中的金霉素對人體健康構成了潛在的危害［1，2］。大部分國家對動物性食品中金霉素的殘留做出了嚴格的限定。我國國標GB/T 22990-2008 和GB/T 5009.116-2003 規定了牛奶及畜、禽肉中金霉素殘留量，其中牛奶中最高限量為0.1 μg/mL。

目前，檢測金霉素的常用方法包括高效液相色譜法(HPLC)［3，4］、免疫分析法［5，6］、毛細血管電泳法［7］、微生物培養法［8］，其中，HPLC法雖然應用最廣，檢測結果精準可靠，但對樣品純度要求較高，無法滿足大批量樣本快速篩查的需要;免疫分析法對樣品純度要求不高，但檢測結果重現性差;毛細血管電泳法分析速度快，但靈敏度低;微生物培養法適合大量樣品篩選，但受抗菌活性雜質的影響不適于定量分析。

分子印跡聚合物(MIPs)具有較強的特異性的分子識別能力，且耐高溫、高壓及酸堿腐蝕［9］，在制備不同功能的傳感器方面，已得到廣泛應用［10，11］。由于兼具操作簡便、造價低廉、易于自動化等優勢，基于電化學聚合法所制備的印跡膜傳感器近年來得到迅速發展［11～13］，所用的單體包括苯胺和吡咯等［14，15］。而以鄰氨基酚為單體，可在不同電極表面電聚合，膜厚度可控制在10 ～100 nm，且羥基作為潛在的配位位點，可進一步提高傳感器的性能［16］。本研究采用循環伏安(CV)法，以鹽酸金霉素為模板分子，鄰氨基酚為聚合單體，構建了測定鹽酸金霉素的分子印跡敏感膜電化學傳感器，與Guerreiro 等［17］制備的金霉素印跡聚合物膜離子選擇性電極相比，本傳感器具有更低的檢測下限，操作更簡便。整個過程無需衍生化處理，響應快，成本低，選擇性良好，可以滿足鹽酸金霉素痕量分析的要求，有望在食品檢測中得到更好的應用。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

LK2005A 型電化學工作站(天津市蘭力科化學電子高技術有限公司);電化學測試采用三電極系統，玻碳電極為工作電極(GCE，Φ=4 mm)，鉑片電極為對電極，Ag/AgCl 電極為參比電極(天津艾達恒晟科技發展有限公司);超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

鹽酸金霉素(Chlortetracycline，CTC，純度＞97%，上海生工生物工程有限公司)，配制成濃度為1 × 10-3mol/L 儲備液，于4 ℃避光保存，使用時逐級稀釋;其它試劑均為分析純;牛奶和雞肉購于本地超市;實驗用水均為二次蒸餾水。

2.2 玻碳電極的預處理

將玻碳電極依次用1.0，0.30 和0.05 μm 粒度的α-Al2O3拋光粉研磨拋光，而后依次用HNO3(1 +1)無水乙醇和二次蒸餾水分別超聲清洗2 ～3 min，再將電極置于0.5 mol/L H2SO4溶液中用循環伏安法活化，掃描范圍為-0.1 ～1.0 V，反復掃描直至得到陰、陽極峰對稱且穩定的循環伏安(CV)圖為止，峰峰電位差在64mV 以下，取出電極待用。

2.3 分子印跡及非分子印跡修飾電極的制備

將0.1 g 鄰氨基酚(OAP)溶于0.1 mol/L HClO4中，并加入0.4 mol/L NaOH 調節至弱酸性(pH 5.5)，定容至250 mL(36.7 mmol/L)。從中移取9 mL，向其中加入1 mL 0.001 mol/L 鹽酸金霉素(CTC)，混合均勻。通N2除O2約15min，再將三電極系統浸入到含有CTC 和OAP 的NaClO4底液中，采用CV 法掃描30 圈，掃描電位為-0.2 ～1.2 V，掃描速度為50 mV/s，在玻碳電極表面得到電聚合膜，即制得含CTC 的聚合膜電極(CTC-MIP-POAP/GCE)。將玻碳電極浸入含有10mL 甲醇-0.5 mol/L H2SO4混合溶液(1∶4，V/V)洗脫24 h，二次蒸餾水淋洗1 min，得到留有CTC 分子構型孔穴的分子印跡敏感膜(MIPPOAP/GCE)。在同樣條件下，制備不加入CTC 印跡分子的非印跡膜修飾電極(POAP/GCE)。

2.4 實際樣品分析

5 mL 牛奶置于50 mL 離心管，加入20 mL MCllvaine-EDTA 緩沖液及2 mL 三氯乙酸，漩渦混合2 min，在4 ℃下以4000 r/min 離心20 min，取上清液待用。稱取5.00 g 切碎的肉樣置于50 mL 錐形瓶中，加入5% HClO4溶液25 mL，于振蕩器上振蕩提取10 min，移入離心管中，以2000 r/min 離心3 min，取上清液經0.45 μm 濾膜過濾，收集濾液待用。分別取兩份上清液及濾液2 mL，用PBS 分別稀釋至10 mL 作為樣品溶液。

3 結果與討論

3.1 電化學制備分子印跡聚合膜

圖1A 為模版分子CTC 存在下玻碳電極上OAP 電聚合過程中的CV 曲線。由CV 曲線可見，OAP的電化學聚合是一個不可逆的過程。從掃描的第二圈開始，電流便出現明顯的驟降，并隨著CV 掃描圈數的增多，電流緩慢下降至背景值，這表明了電極表面上逐漸覆蓋并形成了致密的非導電聚合膜，阻止了OAP 的進一步氧化，使得伏安電流響應受到抑制。而圖1B 為不加入CTC 的OAP 電聚合的CV 曲線，與圖1A 相比并無顯著差異，這表明CTC 的存在不干擾OAP 的電聚合。

3.2 分子印跡效應

采用CV 及DPV 法表征了不同電極在0.005 mol/L K3［Fe(CN)6］的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 6.4)中的特性(圖2)。由DPV 表征曲線(圖2A)可知，裸電極(GCE)(曲線a)具有了較大的還原峰電流，說明探針離子［Fe(CN)6］3-在GCE 表面發生了電化學反應，從而產生了峰電流。而非印跡膜電極(POAP/GCE)(曲線d)相較于GCE，幾乎沒有還原峰出現，這是由于覆蓋于電極上的不含CTC 的POAP/GCE 電極是非導電的，阻礙了探針［Fe(CN)6］3-的擴散傳遞。印跡膜電極(MIP-POAP/GCE)(曲線b)相對于POAP/GCE 而言，還原峰電流有了明顯的大幅度提高，這是由于CTC-MIP-POAP/GCE 膜經洗脫后所留有的印跡孔穴為［Fe(CN)6］3-提供了傳質通道，在電極表面發生了電化學反應。而洗脫再吸附CTC 的印跡膜電極(曲線c)相較于MIP-POAP/GCE 則出現峰電流值的下降，說明2 × 10-7mol/L CTC 經印跡膜所留有的孔穴，被吸附至MIP-POAP/GCE 電極上，一部分印跡孔穴被吸附上的CTC 阻塞，使得［Fe(CN)6］3-傳質通道減少。CV 法與DPV 法的表征結果相符。

圖1 OAP 電化學聚合的循環伏安曲線:(A)加入CTC 的OAP 的NaClO4 底液;(B)OAP 的NaClO4底液(掃速:50 mV/s，掃描次數:30)Fig.1 Cyclic voltammograms for the electrochemical polymerization of o-aminophenol (OAP)in the presence (A)and absence (B)of chlortetracyline (CTC)in sodium perchlorate aqueous solution (Scan rate:50 mV/s，cycling number:30)

圖2 不同電極在含0.005mol/L［Fe(CN)6］3-、0.1 mol/L KCl 的磷酸鹽緩沖液(pH 6.4)中的差分脈沖伏安圖(A)和循環伏安圖(B)Fig.2 Differential pulse voltammograms (A)and cyclic voltammograms (B)of the electrodes in phosphate buffer solution of pH 6.4 containing 0.1 mol/L KCl and 0.005 mol/L K3［Fe (CN)6］

3.3 吸附時間對CTC分子印跡膜電化學響應的影響

響應時間是表征傳感器性能的一個重要參數，將MIP-POAP/GCE 膜電極浸入一定濃度金霉素溶液中進行靜置吸附，每隔2 min 取出，并用二次蒸餾水淋洗干凈，在0.005 mol/L K3［Fe(CN)6］PBS 中用DPV 法檢測。結果表明，隨著吸附時間延長，峰電流逐漸下降，表明印跡位點逐漸被金霉素分子所占據，當吸附時間超過20 min 后，峰電流基本達到平衡。因此選擇20 min 為最佳吸附時間。

3.4 CTC印跡膜的選擇性

選擇四環素、土霉素、氯霉素及青霉素作為干擾物并采用DPV 法考察MIP-POAP/GCE 膜電極對CTC 的選擇性。分別測定了修飾膜印跡電極對含5 ×10-6，7.5 ×10-6，1 ×10-5，1.5 ×10-5，2 ×10-5，4×10-5和8 ×10-5mol/L 的鹽酸金霉素及干擾物溶液的響應，計算相對峰電流變化率(Δi/i0)，其中，Δi為MIP-POAP/GCE 膜電極對各種物質響應前后的峰電流差值，i0為印跡膜經洗脫后的峰電流值。如圖3所示，氯霉素和青霉素對鹽酸金霉素幾乎無干擾，土霉素和四環素產生了極微弱的電流響應。這是由于氯霉素及青霉素與CTC 的結構差別較大，電化學響應信號變化極其微弱，而土霉素和四環素與CTC 的結構相似，這使得有少量土霉素及四環素能夠被吸附到印跡分子修飾電極的孔穴上，從而引起微弱的電化學響應，但對CTC 并沒有形成顯著干擾。這說明印跡膜修飾電極與模板分子之間的作用不單是由與其互補的官能團所決定，立體結構互補所形成的印跡孔穴也有較大影響。

3.5 印跡膜電極的電化學響應及標準曲線

印跡膜傳感器在含0.005 mol/L K3［Fe(CN)6］的10 mL PBS(含0.1 mol/L KCl，pH 6.4)中逐次加入等分試樣20 μL 的1 ×10-5mol/L 的CTC，DPV 法進行測定(圖4A)。將MIP-POAP/GCE 膜電極在空白溶液中所測得的峰電流與吸附不同濃度CTC 的CTCad-MIP-POAP/GCE 膜電極所測得的峰電流的差(ΔI)，與CTC 濃度的作圖，得到測定CTC 濃度的標準曲線(圖4B)。CTC 在2.0 ×10-8～6.1 ×10-7mol/L 范圍內與DPV 峰電流減少量呈線性關系，線性方程為y=11.19 +279.43x，R2=0.9989，CTC 的檢出限為1.5 ×10-8mol/L(3σ)。

不同方法檢測CTC 的結果見表1。與其它方法相比，本傳感器具有更低濃度的線性范圍，檢出限也更低，適用于快速檢測低濃度水平的鹽酸金霉素。

圖3 不同物質在分子印跡膜電極上的相對峰電流變化率Fig.3 Δi/i0 ratio changes of MIP sensor vs.concentration of different substances

圖4 (A)不同鹽酸金霉素濃度下的差分脈沖伏安圖;(B)鹽酸金霉素濃度與峰電流差的關系Fig.4 (A)DPV curves of MIP-POAP/GCE after adsorption in different concentrations of CTC and(B)current peak difference vs CTC concentration on MIP-POAP/GCE

表1 本方法與其它方法檢測金霉素的結果比較Table 1 Comparison of detection results of CTC by this method and literature methods

3.6 印跡膜電極的重現性與穩定性

使用過的印跡膜電極在洗脫溶液甲醇-0.5 mol/L H4SO4混合溶液(1∶4，V/V)中超聲清洗5 min，并用二次蒸餾水淋洗后即可使電極基本能恢復到使用前的響應值。因此使用同一支印跡膜電極對2 ×10-7mol/L CTC 平行測定5 次，RSD 為1.9%，顯現出較好的重現性。將此印跡膜電極儲存于4 ℃冰箱中，2 周后在相同條件下下對2 ×10-7mol/L CTC 的測定值降至初始響應的90.3%。經4 周后，響應值降至初始響應的82.7%，具有良好的長期穩定性。

3.7 樣品分析

取市售的牛奶和雞肉樣品，經本方法檢測均未檢出CTC。向牛奶及雞肌肉組織空白樣品溶液中加入0.1，0.2 和0.5 μmol/L 的CTC，每個濃度平行測定3 次，經MIP-POAP/GCE 膜電極吸附后，置入含0.005 mol/L K3［Fe(CN)6］、0.1mol/L KCl 的PBS 中檢測，測定結果如表2 所示?；厥章蕿?6.4% ～96.9%，RSD 為1.7% ～6.8%，可滿足實際樣品分析的需要。

表2 牛奶及雞肉組織樣品中CTC 的加標回收率Table 2 Recovery of CTC in milk and chicken muscle tissue samples

1 Fang H，Han Y L，Yin Y M，Pan X，Yu Y L.J.Chemosphere.，2014，96:51 －56

2 Alaboudi A，Basha E A，Musallam I.J.Food Control.，2013，33(1):281 －286

3 Patyra E，Kowalczyk E，Kwiatek K.J.B.Vet.I.Pulawy.，2012，56(3):329 －333

4 WANG Lei，XU Zhi-Xiu，ZHANG Xiao-Song，SHAO Xue-Guang.Chinese J.Anal.Chem.，2003，31(1):52 －54

王蕾，徐智秀，張孝松，邵學廣.分析化學，2003，31(1):52 －54

5 Le T，Yi S H，Zhao Z W，Wei W.Food.Addit.Contam.，2011，28(11):1516 －1523

6 WU Yu-Xiang，LIU Zhi-Guo，HAN Zeng-Fei，ZHANG Lu，SUN Tian.J.Food Sci.，2008，29(7):348 －351

武玉香，劉志國，韓增飛，張露，孫田.食品科學，2008，29(7):348 －351

7 ZHANG Lan，LIN Zi-An，XIE Zeng-Hong.Chinese J.Analysis and Testing Technology and Instruments，2004，10(1):18－23

張蘭，林子俺，謝增鴻.分析測試技術與儀器，2004，10(1):18 －23

8 LIU Xing-Quan，FENG Zhen，YAO Lei，LI Bo-Bin.Chinese J.Modern Food Science and Technology，2011，27(4):465 －467

劉興泉，馮震，姚蕾，李博斌.現代食品科技，2011，27(4):465 －467

9 Puoci F，Iemma F，Cirillo G，Curcio M，Parisi O I，Spizzirri U G，Picci N.J.Eur.Polym.，2009，45(6):1634 －1640

10 Amut E，Fu Q，Fang Q，Liu R，Xiao A，Zeng A，Chang C.J.Polym.Res.，2010，17(3):401 －409

11 ZHANG Lian-Ming，LI Jian-Ping，PAN Hong-Cheng.Chinese J.Anal.Chem.，2012，40(7):1025 －1030

張連明，李建平，潘宏程.分析化學，2012，40(7):1025 －1030

12 Rosy，Chasta H，Goyal R N.Talanta，2014，125:167 －173

13 WANG Lin，TAN Xue-Cai，ZHAO Dan-Dan，LIU Li，LEI FU-Hou，HUANG Zai-Yin，GONG Qi.Chem.J.Chinese Universities，2012，33(8):1708 －1713

王琳，譚學才，趙丹丹，劉力，雷福厚，黃在銀，龔琦.高等學?；瘜W學報，2012，33(8):1708 －1713

14 ZHANG Jin，XU Lan，WANG Ya-Qiong，LV Rui-Hong.Chinese J.Anal.Chem.，2009，37(7):1041 －1044

張進，徐嵐，王亞瓊，呂瑞紅.分析化學，2009，37(7):1041 －1044

15 QI Yu-Bing，LIU Ying，SONG Qi-Jun.Chinese J.Anal.Chem.，2011，39(7):1053 －1057

齊玉冰，劉瑛，宋啟軍.分析化學，2011，39(7):1053 －1057

16 Tucceri R，Arnal P M，Scian A N.Canadian J.Chem.，2012，91(2):91 －112

17 Guerreiro J R L，Freitas V，Sales M G F.Microchem.J.，2011，97(2):173 －181