2，2-二苯基-1-苦肼基-高效液相色譜法快速篩選亞麻籽抗氧化活性成分

劉明鈺 李敏 陳娟娟 郭嫻 嚴小軍

(寧波大學應用海洋生物技術教育部重點實驗室，寧波315211 )

1 引言

自由基能夠引起脂質過氧化、DNA 氧化損壞等重要分子物質損傷［1，2］，同時還會引起慢性病［3，4］，因此，尋找有效的抗氧化劑對人體健康具有非常重要的作用。亞麻籽含有大量的α－亞麻酸和亞麻木酚素，是其它植物含量的600 ～700 倍［5］，在食品領域和疾病治療方面具有重要應用［6，7］。木酚素和雙酚化合物耦合物生成了兩種松柏醇，形成一個抗氧化防御系統［8］，開環異落松樹脂酚二葡萄糖苷(Secoisolariciresinol Diglucoside，SDG)、開環異落葉松樹脂酚(Secoisolariciresinol，SECO)作用生成二糖苷SDG 是典型的木酚素類［9，10］。大量研究表明，亞麻籽中的SDG 和SECO，哺乳動物中的腸二醇(Enterodiol，ED)和腸內酯(Enterolactone，EL)具有抗氧化活性，SDG 由人類結腸微生物群落水解代謝產生ED，ED 進一步被氧化產生EL［11］。因此，亞麻籽中抗氧化成分的快速篩選具有重要意義。

通過體內抗氧化活性檢測，能夠更準確地反應出抗氧化劑作用于生物體的真實抗氧化性能，但同時體內抗氧化活性檢測受干擾因素也極其多，對實驗結果的影響非常大，這樣導致實驗重復性降低。而傳統的體外抗氧化測定方法要求化合物純度高、價格昂貴，檢測方法費力、耗時。本方法采用高效液相色譜法在線分離和評價抗氧化活性，具有穩定性好、結果準確的優點［12，13］。抗氧化劑與2，2－二苯基－1－苦肼基(2，2－diphenyl－1－picrylhydrazyl，DPPH)自由基混合后，其活性或抗氧化能力衰減［14，15］，高效液相色譜方法將抗氧化劑與DPPH 自由基分離，根據反應前后抗氧化劑峰面積變化量計算抗氧化劑的抗氧化活性。因此，抗氧化能力衰減是一種快速、可靠地測量自由基清除活性的方法，尤其是在復雜混合物中。

本研究以SDG、SECO 和ED 為研究對象，建立了抗氧化物質活性篩選的DPPH－HPLC法。利用超高效液相色譜－飛行時間質譜(Ultra performance liquid chromatography coupled with quadruple time－of－flight mass spectrometry，UPLC－Q－TOF－MS)鑒定亞麻籽提取物中化合物成分。利用本方法對亞麻籽提取物的活性物質進行了抗氧化活性能力比較。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Waters 2695 液相色譜儀、Waters 2998PDA 紫外檢測器，Waters Q－TOF premier 四極桿飛行時間質譜儀(美國Waters 公司);酶標儀(日本Thermo 公司);超聲儀(寧波新芝生物科技有限公司)。

脫脂水解過的亞麻籽提取物(長沙捷凱生物制品有限公司);SDG，SECO 和ED(上海田同公司);DPPH(美國Sigma－Aldrich 公司);甲醇、乙腈(色譜純，德國Merck 公司);純水由超純水系統制備。

2.2 儀器工作條件

2.2.1 色譜條件 C18色譜柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm)，柱溫30 ℃;流動相:乙腈(A)，水(B);梯度洗脫:0 ～5 min，10% ～15% A;5 ～15 min，15% ～25% A;15 ～45 min，25% A;45 ～50 min，25% ～70% A;50 ～55 min，70% A;55 ～60 min，70% ～90% A。流速0.6 mL/min，進樣體積10 μL，檢測波長280 nm。

2.2.2 超高效液相色譜-飛行時間質譜條件 亞麻籽活性成分分析采用Waters ACQUITY 超高效液相色譜系統(UPLC)，使用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(50 mm ×2.1 mm，1.7 μm)作為固定相。流動相為:乙腈(A)－水(B);梯度洗脫:0 ～5 min，10% ～15% A;5 ～15 min，15% ～25% A;15 ～45 min，25% A;45 ～50min，25% ～70% A;50 ～55 min，70% A;55 ～60 min，70% ～90% A;流速0.6 mL/min，進樣體積10 μL。柱后1∶4 分流進入質譜。高分辨質譜儀采用Waters Q－TOF premier 質譜儀。質譜儀條件:離子源為ESI，質量分析器為四極桿飛行時間，正離子檢測模式，離子源溫度150℃，脫溶劑溫度300 ℃，脫溶劑氮氣流速400 L/h，錐孔反吹氮氣，毛細管電離電壓3.0 kV，取樣錐孔電壓為80 V，四極桿掃描范圍為m/z 50 ～1200。根據不同的物質，全程掃描(Full scan)質譜碰撞能量在25 ～35 eV。使用亮腦啡肽(m/z 556.2771，［M+H］+)作為外標物，對目標離子進行精確質量分析。

2.3 樣品前處理

取亞麻籽粉末100 mg，加入2 mL 甲醇溶液，常溫下超聲60 min，過濾除殘渣，將上清液蒸干，以甲醇溶解，置于-4 ℃保存待用。

2.4 標準品溶液的配制

分別稱取SDG，SECO 和ED 3 種標準品各0.2 mg，加入乙腈－水(1∶ 1，V/V)溶液1 mL，配成0.2 g/L 儲備溶液，再分別稀釋成10，25，50，100 和200 mg/L 的標準工作溶液。

2.5 抗氧化能力測定

2.5.1 DPPH-HPLC法 按樣品與DPPH 體積比1∶1 進行混合、反應，反應時間為30 min，檢測波長設定為200 ～600 nm。按2.2.1 節色譜條件，每個樣品測3 個平行取平均值。抗氧化劑清除率(Scavenging ratio of the antioxidant，SRA)作為衡量DPPH 自由基清除活性的指標，其計算公式如下:

其中，Sblank是指與DPPH 自由基反應前抗氧化劑的含量;Ssample是指與DPPH 自由基反應后抗氧化劑的含量。SRA 值代表抗氧化劑在與DPPH 自由基反應過程中的減少率。

2.5.2 酶標儀法準確稱取0.2 mg 的SDG，SECO，ED 和DPPH，各溶于無水乙醇，配成濃度為0.2 g/L的儲備溶液，于-4 ℃保存待用。各取50 μL 溶液置于96 孔板中，酶標儀波長設定在517 nm，37 ℃孵化30 min 后，測定各溶液吸光度值，每個樣品平行測3 次取平均值［16］。自由基清除率(Scavenging ratio，SR)計算公式如下:

其中，Asample為DPPH 自由基與抗氧化劑反應30 min 后溶液吸光度，Acontrol為DPPH 溶液吸光度。

3 結果與討論

3.1 反應時間對抗氧化能力的影響

將配制好的標準工作液在高效液相色譜儀上進行測定，以標準品的質量濃度為橫坐標，以色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線(表1)。3 種標準品SDG，SECO 和ED 在10 ～200 mg/L 濃度范圍內線性關系良好，相關系數均大于0.995，分別以信噪比(S/N)為3 和10 的標準樣品量為檢出限和定量限，可算出SECO，SDG 和ED 的檢出限為5.4 ～7.7 mg/L，定量限為18 ～26 mg/L。經過連續3 天重復測定，得出日內和日間的相對標準偏差均小于5.0%，說明高效液相色譜測定抗氧化劑的抗氧化活性方法準確、穩定、可行性高。

表1 SDG，SECO 和ED 的線性方程，檢出限和定量限Table 1 Linearity，LOD and LOQ of SDG，SECO and ED

此外，考察了自由基清除活性與反應時間之間的關系。將3 種標準品SDG，SECO 和ED 分別與DPPH 反應10，20，30，40，50 和60 min，平行3 次，計算其SRA 值(圖1)。結果表明，抗氧化劑與DPPH自由基的反應在很短時間內就可以達到平衡，且SRA 值在不同反應時間下的變化較小，相對標準偏差均小于7.9%，可以忽略時間對SRA 值的影響，使得本實驗更加可靠和便利。

3.2 DPPH-HPLC法在單一標準品中的應用

分別將0.1 mL 濃度為0.2 g/L 的3 種標準品溶液(SECO、SDG、ED)與0.1 mL 0.2 g/L DPPH 自由基混合反應20 min，經液相色譜分析，計算出濃度為Ssample。分別將0.1 g/L 的3 種標準品(SECO，SDG和ED)溶液直接進行液相色譜分析，計算出濃度為Sblank。通過上述SRA 計算公式，得到3 種標準品的自由基清除率(表2)。根據SRA 值可見，自由基清除活性順序為:SDG ＞SECO ＞ED。3 種標準品和DPPH 反應前后液相色譜圖見圖2。

圖1 抗氧化劑SDG，SECO 和ED 自由基清除率對時間關系圖Fig.1 Free radical scavenging rate variation of SDG，SECO and ED over time

表2 單一標準品和混合標準品的自由基清除率Table 2 Seavenging ratio of the antioxidant (SRA)of SDG，ED and SECO by 2，2－diphenyl－1－picrylhydrazyl (DPPH)－HPLC assay and microplate reader assay

采用傳統的酶標儀測試SECO，SDG 和ED 對DPPH 的自由基清除率(SR，按公式(2)計算)。由表2可知，DPPH 自由基清除能力順序為SDG ＞SECO ＞ED。該結果表明，采用酶標儀法結合DPPH 自由基的消失量計算的抗氧化劑清除自由基能力，與采用HPLC 方法結合抗氧化劑的消失量計算抗氧化劑清除自由基能力一致，從而進一步驗證了DPPH－HPLC法測試抗氧化劑清除自由基能力的可靠性和準確性。

3.3 DPPH-HPLC法在混合標準品的應用

將標準品SECO，SDG 和ED 兩兩混合，或3 種混合后，再與DPPH 反應，結果見表2，可知在兩兩混合或者三者混合標準品中，SECO，SDG 和ED 的DPPH 自由基清除能力均比單一標準品情況減弱，但仍可以發現DPPH 自由基清除率為SDG ＞SECO ＞ED，與單一標準品清除自由基的活性順序一致。因此本方法可用于對天然產物的復雜提取物進行活性篩選。

3.4 DPPH-HPLC法在亞麻籽復雜提取物中的應用

圖2 (A)為SECO，SDG 和ED 混合標準品與DPPH 自由基反應前后的液相色譜圖;(B)為亞麻籽提取物與DPPH 自由基反應前后的液相色譜圖Fig.2 (A)Liquid chromatogram before and after the reaction of DPPH and the mixture of SECO，SDG and ED;(B)Liquid chromatogram before and after the reaction of flax extractive and DPPH

將本方法應用于復雜提取物中抗氧化劑快速篩選，亞麻籽提取物在280 nm 波長下檢測發現，亞麻籽提取物中5 種主要抗氧化成分參與DPPH 自由基清除(圖2B)。根據高分辨質譜信息，對5 種亞麻籽抗氧化劑的結構進行解析，結構信息如圖3 所示。化合物4 和5 在質譜的正離子模式下的準分子離子峰為m/z 704.3100，在高能量模式下獲得相同的碎片離子m/z 363.2797，345.1663，327.1570，295.1361，221.1186 和163.0747，因此可以判斷化合物4 和5 為一對異構體，并且與標準品SDG 的準分子離子峰和碎片離子峰一致。再利用液相色譜的保留時間進行比對，因此判斷化合物4 為SDG，化合物5 為SDG 異構體。化合物1 在正離子模式下得到［M + Na］+m/z 575.2081，在高能量模式下，得到碎片離子m/z 413.1533，為母離子中性丟失162 Da，即葡萄糖苷。繼續丟失48 Da，即CH2O+H2O碎片產生碎片離子m/z 365.1385。碎片離子m/z 219可推測為2－甲氧基苯酚。結合上述碎片離子和文獻報道結果，該化合物可鑒定為(7α-［(β－D－glupyranosyl］oxy)－1－methoxyisola－riciresinol)。化合物2 的［M+Na］+離子為m/z 413.1558，在高能量模式下得到碎片離子m/z 269.1390和167.0713，可以說明有2，4－二甲氧基苯酚基團存在。碎片離子m/z 139.0567 和123.0432 表明結構中含有2－甲氧基苯酚基團。且整個碎片中未找到丟失糖基的相關碎片，并結合文獻報道，化合物2 可推測為(6R，7R，8S)－1－Methoxyisolariciresinol。化合物3 的準分子離子峰為［M+Na］+m/z 649.1358。母離子連續丟失兩分子的葡萄糖苷生成碎片離子m/z 487.0864 和325.0331。其分子量和碎片離子符合蜀葵苷元二葡萄糖苷(Herbacetindiglucoside)的結構特性，并且已有相關文獻報道了在亞麻籽中存在該化合物，因此推測化合物3為蜀葵苷元二葡萄糖苷。

這5 種抗氧化劑表現出較強的DPPH 自由基清除能力。由表3 可知，自由基清除能力為SDG 異構體(5)＞SDG (4)＞7α-［(β－D－glupyranosyl)oxy］－1－methoxyisolariciresinol (1)＞(6R，7R，8S)－1－Methoxyisolariciresinol (2)＞蜀葵苷元二葡萄糖苷(3)。結合這5 種抗氧化劑，標準品SDG，SECO 和ED 的SRA 數據及其結構信息可知，除了化合物3 為黃酮類物質，其余均為木酚素。比較化合物1，2，4 和5發現，它們具有非常類似的結構，化合物1 和2 含有六元環，而化合物4 和5 不存在六元環，結果表明，不存在六元環的化合物4 和5 具有較強的DPPH 自由基清除能力，而化合物1 和2 的DPPH 自由基清除能力較差。比較SDG 和SECO，以及化合物1 和2 可知，相似結構中，含有葡萄糖苷化合物具有較強的自由基清除能力，即SRA 值:SDG ＞SECO，化合物1 ＞化合物2。根據上述數據可知，構效關系在活性篩選中起到了重要作用。

圖3 SDG、SECO、ED 以及5 種亞麻籽抗氧化劑的結構Fig.3 Structure of SDG，SECO，ED and five antioxidants of flax seed

表3 亞麻籽提取物的DPPH 自由基清除率Table 3 The scavenging ratio of antioxidant (SRA)values of five lignans from flax seed extracts

4 結論

本實驗利用HPLC－DPPH 方法分離篩選出亞麻籽提取物中5 種抗氧化成分，同時對其抗氧化活性進行分析。本方法簡便、快速、分離度高、穩定性好，可以對復雜混合物直接進行分析，不用對混合物進行分離純化，節省了分析時間，適用于粗提物中抗氧化成分的快速分析。

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