反相高效液相色譜法同時測定丁酸氯維地平中10種相關雜質

劉艷華 呂狄亞 宋志勇 鄭濱興， 張倩倩， 陸峰 許激揚

1 (中國藥科大學生命科學與技術學院南京210009)

2(第二軍醫大學藥學院，上海200082)

3(太原理工大學化學化工學院，太原030024)

1 引言

丁酸氯維地平(Clevidipine butyrate，CLE)，其化學名為4－(2，3－二氯苯基)－1，4－二氫－2，6－二甲基－3，5－吡啶二甲酸甲基(1－丁酰氧基)甲酯(圖1)，是由英國AstraZeneca 公司研制開發的一種新型的靜脈注射用抗高血壓藥物，于2008 年8 月經美國FDA 批準上市［1］，主要用于急性高血壓的治療及術后血壓的控制［2］。

丁酸氯維地平是一種超短效二氫吡啶類鈣離子通道拮抗劑，可選擇性抑制動脈血管平滑肌細胞外的鈣離子內流［3］，其起效迅速，劑量響應呈線性，半衰期短(1 ～2 min)，作用結束也迅速，因此可以通過對劑量的精細調節起到降壓效果，有助于醫生在臨床使用中根據患者的具體血壓監測值采取個體化用藥，還可以避免一次用藥過量導致過度降壓卻無法糾正的危險［4］。與硝酸甘油、硝普鈉相比，丁酸氯維地平維持血壓更為有效且更加安全［5，6］。

丁酸氯維地平原料藥在合成及儲存過程中有可能產生反應副產物及降解產物，經分析及自行合成鑒定，主要有水解雜質(以下簡稱為雜質1):4－(2，3－二氯苯基)－1，4－二氫－2，6－二甲基－3，5－吡啶二羧酸單甲酯;雙腈雜質(雜質2):二氰基乙基－4－(2，3－二氯苯基)－1，4－二氫－2，6－二甲基－3，5－吡啶二羧酸酯;重排雜質1(雜質3):6－(2，3－二氯苯基)－2－甲基－4－氧代環己烯－2－甲酸甲酯;脫羧氧化雜質(雜質4):4－(2，3－二氯苯基)－2，6－二甲基－3－吡啶甲酸甲酯;重排雜質2(雜質5):6－(2，3－二氯苯基)－4－甲基－2－氧代環己烯－3－甲酸甲酯;雙甲酯雜質(雜質6):4－(2，3－二氯苯基)－1，4－二氫－2，6－二甲基－3，5－吡啶二羧酸二甲酯;脫羧雜質(雜質7):4－(2，3－二氯苯基)－1，4－二氫－2，6－二甲基－3－吡啶甲酸甲酯;氧化雜質(雜質8):4－(2，3－二氯苯基)－2，6－二甲基－3，5－吡啶二羧酸甲基(1－氧代丁氧基)甲基酯;乙酯雜質(雜質9):4－(2，3－二氯苯基)－1，4－二氫－2，6－二甲基－3，5－吡啶二羧酸乙基(1－氧代丁氧基)甲基酯;雙丁酯雜質(雜質10):4－(2，3－二氯苯基)－1，4－二氫－2，6－二甲基－3，5－吡啶二羧酸雙(1－氧代丁氧基)甲酯，各種雜質的結構見圖1。

目前，對丁酸氯維地平的安全性考察及血/尿樣處理及含量測定方法的報道較多［7，8］，主要集中在血藥濃度及生物利用度上，而關于有關物質測定方法的報道并不多見，袁慧雅等［9］僅對丁酸氯維地平及其中間體(雜質1)進行了研究，并未對其它有關物質進行分析，不能全面分析該藥物的質量。本研究建立的RP－HPLC 測定有關物質的方法，能夠很好地分離丁酸氯維地平及各個雜質，且方法準確可靠，耐用性良好，可簡便、快速地測定丁酸氯維地平中的10 種有關物質。

圖1 丁酸氯維地平(CB)及各雜質(IMP)結構Fig.1 Structures of clevidipine butyrate (CB)and impurities (IMP)

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Agilent 1260 高效液相色譜儀(美國Agilent 公司)配DAD 檢測器;電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司);pH 計(丹佛儀器有限公司);KQ－250E 型超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司);渦旋混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

雜質1、雜質2、雜質4、雜質6、雜質7、雜質8、雜質9、雜質10 均為自制，雜質3 和雜質5 為深圳市倍素特科技有限公司提供，批號分別為20131226－3、20131226－5;經上海醫藥工業研究院鑒定，雜質1 ～10 純度分別為97.61%，94.34%，85.05%，99.17%，98.48%，99.56%，90.54%，99.25%，98.48%和98.61%;丁酸氯維地平對照品為自制，純度為99.81%;各自制雜質對照品及丁酸氯維地平對照品均按規定標化。

無水NaH2PO4、H3PO4(分析純，國藥集團化學試劑有限公司);水為超純水;乙腈、甲醇(HPLC 級，Merck 公司)。

2.2 溶液配制

2.2.1 系統適用性溶液 準確稱取各雜質標準品，加50%乙腈溶解并定容，搖勻，配制成2000 mg/L單標儲備液;準確移取各標準儲備液0.5 mL 混合于10 mL 量瓶中，50%乙腈定容，配制成100 mg/L 混合標準工作液。另準確稱取丁酸氯維地平對照品40 mg，置10 mL 量瓶中，加入0.4 mL 混合標準工作液，加入50%乙腈溶解并定容，即得每1 mL 含丁酸氯維地平對照品4.0 mg，各雜質4.0 μg 的適用性溶液。

2.2.2 供試品溶液 準確稱取本品適量，加50%乙腈溶解并定容，配制成每1 mL 含丁酸氯維地平4.0 mg 的供試品溶液。

2.2.3 對照品溶液 準確稱取適量丁酸氯維地平對照品，用50%乙腈溶解并定容，配制200 mg/L 對照品儲備液，準確移取儲備液1 mL 于10 mL 容量瓶中，用50%乙腈定容，制成20.0 mg/L 對照品溶液。

2.3 色譜條件

Symmetry C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);進樣體積:20 μL;柱溫:35 ℃;流動相A 為0.05 mol/L NaH2PO4(用H3PO4調至pH 2.5)，B 為乙腈－甲醇(3∶2，V/V)，梯度洗脫:0.0 ～14.0 min，50% ～60% B;14.0 ～42.0 min，60% B;42.0 ～44.0 min，60% ～70% B;44.0 ～63.0 min，70% B;63.0 ～65.0 min，70% ～50% B。檢測波長:220 nm;流速:1.5 mL/min。

2.4 強制破壞處理

分別取本品40 mg 于10 mL 容量瓶中，經高溫、光照、強酸、強堿和氧化破壞。各破壞條件如下:(1)高溫破壞:120 ℃保溫24 h;(2)光照破壞:(4500 ±500)lx 光照20 d;(3)強酸破壞:加入1 mL 2 mol/L HCl，70 ℃保溫4 h;(4)強堿破壞:加入1 mL 1 mol/L NaOH，室溫放置1 h;(5)氧化破壞:加入30%(w/w)H2O21 mL，70 ℃保溫4 h。將破壞后樣品加50%乙腈溶解并定容(酸、堿破壞樣品需先分別中和)，即得。

3 結果與討論

3.1 雜質來源解析

根據丁酸氯維地平合成路線及其破壞性實驗結果，對各雜質的來源進行分析，見圖2。

圖2 各雜質降解途徑解析Fig.2 Showing potential impurities arising from side reaction and degradating

3.2 高效液相色譜條件的優化

本研究系統地優化了檢測波長、色譜柱、流動相、流速及柱溫等參數，結果見表1。對丁酸氯維地平及其10 種雜質實現了有效分離(各雜質間分離度≥1.5;雜質與主峰間分離度≥2.0)，并對本方法進行了方法學驗證，為丁酸氯維地平原料藥的有關物質測定提供了較為便捷的分析方法。

3.2.1 紫外波長的考察 由各物質的紫外吸收特性可知，雜質4、雜質7、雜質8 僅在末端有吸收，考慮基線穩定，選用220 nm 為檢測波長，在此檢測波長下，主成分及其它雜質也有良好吸收。

3.2.2 色譜柱的考察 分別考察了LP－C18柱(250 mm ×3.0 mm，5 μm)、Waters Symmetry C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent SB－C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、XDB－C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)及ODS－2 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)對適用性溶液中各物質峰之間分離度的影響，結果表明，Waters Symmetry C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)能夠很好地滿足分離要求。

表1 方法優化結果Table 1 Results of method optimization

3.2.3 NaH2PO4溶液的濃度及其pH 的考察 使用NaH2PO4溶液作為流動相的水相，并對其濃度(0.02，0.04 和0.05 mol/L)及pH 值(2.0，2.5 和3.0)進行優化。結果表明，隨著NaH2PO4濃度增加，雜質7 與雜質8 的分離度增大，且當pH=2.5 時，各成分間的分離度最佳，故選擇0.05 mol/L NaH2PO4溶液(pH 2.5)作為水相。

3.2.4 流速的考察 考察流速為1.1，1.3 和1.5 mL/min 時，各峰的分離情況。實驗表明，隨著流速增大，雜質7 與雜質8 及雜質8 與主峰之間分離度均有所改善，并考慮到柱壓及色譜柱的耐用性，并沒有繼續升高流速，最終選擇1.5 mL/min 為最佳流速。

3.2.5 柱溫的考察 在30 ～40 ℃進行分析，隨著溫度升高，雜質7 與雜質8 的分離度增大，而雜質8與主峰的分離度減小;結果表明，在35 ℃時，分離度良好。

3.2.6 溶劑的考察 選擇流動相作為溶劑，丁酸氯維地平及各雜質的溶解性較差，供試品溶液在4 ℃放置數小時后會析出固體;選擇乙腈作為溶劑，雜質1 和雜質2 的色譜峰對稱性差，對稱因子約為2.0;選擇50%乙腈作為溶劑，各母液在4 ℃放置數天均未見析出固體;故最終確定使用50%乙腈作為溶劑。

3.3 專屬性實驗

3.3.1 雜質分離度及空白溶劑實驗 取2.2 節系統適用性溶液、供試品溶液、對照品溶液及空白溶液各20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按出峰前后，對雜質命名，分別為雜質1 ～10，各自保留時間分別為7.657，8.485，13.962，15.316，16.018，17.527，26.385，28.232，41.299 和48.341 min;丁酸氯地平出峰時間為29.911 min;各峰之間均能達到良好分離(各雜質峰之間分離度≥1.5，雜質8 與主峰分離度≥2.0);空白溶劑對有關物質的測定無干擾(圖3)。

3.3.2 強制降解實驗 將本品經高溫、光照、酸、堿和氧化破壞，結果表明，本品在高溫及光照環境中較穩定，基本無降解;對堿性環境極不穩定，主要的降解產物為雜質1 和雜質7。在各降解條件下，丁酸氯維地平與各雜質峰及降解產物均能達到良好分離，方法專屬性良好(圖4)。并且，在強制降解條件下，雜質1、雜質7、雜質8 及雜質10 為丁酸氯維地平主要的降解雜質，對以上4 種雜質進行重點分析。

3.4 線性范圍，檢出限和定量限

稱取各雜質及丁酸氯維地平對照品適量，配制成不同濃度的線性溶液，按2.3 節操作，測定并考察各成分的線性關系及相對校正因子。以進樣濃度(mg/L)為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行回歸曲線分析(表2)。由表2 可知，雜質2 與雜質9 相對于主成分的校正因子在0.9 ～1.1 之間，可采用不加校正因子的主成分外標法測定該物質;對于其它雜質，其校正因子均超出此范圍，因此選用加校正因子的主成分外標法進行研究［10］。

以信噪比(S/N=10)計算方法的定量限，以信噪比(S/N=3)計算方法的檢出限，結果符合要求(表2)。

圖3 系統適用性溶液(a)、空白溶劑(b)、供試品溶液(c)和對照品溶液(d)的色譜圖Fig.3 Chromatograms of system suitability solution (a)，blank solvent (b)，sample solution (c)and reference solution (d)

圖4 高溫(a)、光照(b)、酸(c)、堿(d)、氧化(e)破壞及酸空白(G)、堿空白(H)和氧化空白(I)的色譜圖Fig.4 Chromatograms of heat (a)，light (b)，acid (c)，alkali (d)，oxidation (e)damage and acid blank (G)，base blank (H)and oxidation blank (I)

表2 線性范圍、回歸方程與校正因子Table 2 Linear range，regression equation and correction factor

3.5 精密度實驗

平行配制6 份供試品溶液，按限度加入雜質1、雜質7、雜質8 及雜質10，按2.3 節方法檢測，記錄色譜圖，計算各雜質的RSD 值。雜質1、雜質7、雜質8 及雜質10 的重復性RSD 值分別為0.6%，2.3%，1.3%和1.1% (n=6);結果表明，本方法重復性良好(RSD≤10.0%)。

連續兩天，由兩名操作人員，各平行配制6 份樣品溶液，按限度加入雜質1、雜質7、雜質8 及雜質10，按2.3 節檢測，記錄色譜圖，并計算各雜質的RSD 值(RSD≤15.0%)。雜質1、雜質7、雜質8 及雜質10 的日間精密度RSD 分別為2.6%，2.2%，3.1%，1.4% (n=12);結果表明，本方法的日間精密度良好。

3.6 溶液穩定性實驗

取丁酸氯維地平對照品溶液及加入限度有關物質的樣品溶液，分別在0，5，10，17，24 h 按2.3 節測定，每個時間點各測定2 次。結果表明，對照品溶液峰面積RSD 為1.6% (n=10);雜質1、雜質7、雜質8 及雜質10 的峰面積RSD 分別為1.6%，2.7%，1.8%及3.1%(n =10);結果表明，對照品溶液及各雜質在室溫放置24 h 內穩定性良好(RSD≤5.0%)。

3.7 準確度實驗

采用加標回收實驗，制備加標濃度分別為限度濃度50%，100%和150%水平的供試品溶液，每個水平平行制備3 份。計算所得的回收率應為80% ～120%，RSD≤10.0%。結果表明，雜質1 的回收率為98.75% ～103.76%，平均回收率為101.06%，RSD 為0.9%(n =9);雜質7 的回收率為96.26% ～108.74%，平均回收率為102.8%，RSD 為4.9% (n =9);雜質8 的回收率為94.3% ～106.00% 范圍內，平均回收率為99.6%，RSD 為3.3% (n=9);雜質10 的回收率在100.5% ～113.3% 范圍內，平均回收率為106.6%，RSD 為3.1% (n=9)。結果表明，本方法的準確度良好。

3.8 耐用性實驗

分別考察了不同批號色譜柱、流動相配比、流速和柱溫的微小波動對系統適用性溶液中各峰分離度的影響。結果表明，上述條件微小變化及色譜柱批號變化后，各物質峰之間仍能達到基線分離，雜質峰之間分離度均不小于1.5，雜質8 與丁酸氯維地平之間分離度不小于2.0，說明本方法的耐用性良好。

3.9 樣品分析

取3 批供試品，按2.2 節制備供試品溶液，按2.3 節測定，結果見表3。

表3 有關物質測定結果(%)Table 3 Determination results of related substances (%)

綜上所述，本研究建立了一種簡單、快速、有效的RP－HPLC 分析方法，對丁酸氯維地平進行有關物質的分析，并進行方法學驗證［11］，結果表明，本方法能夠使丁酸氯維地平及其10 種雜質均達到良好的基線分離，且方法靈敏度、耐用性均良好，可以很好地適用于測定丁酸氯維地平中的有關物質。

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