液相色譜-串聯質譜法測定飼料原料中26種霉菌毒素

王瑞國 蘇曉鷗 程芳芳 王培龍 樊霞 張維

(中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，農業部農產品質量安全研究重點實驗室，北京100081)

1 引言

霉菌毒素(Mycotoxins)是由某些霉菌在生長過程中產生的有毒次級代謝產物［1］，飼料原料特別易于被各種霉菌毒素污染［2］，從而對動物生產帶來各種危害。目前，已經確認化學結構的霉菌毒素達400多種［3］。其中，對動物生產影響較大的主要有黃曲霉毒素、嘔吐毒素、T-2 毒素和玉米赤霉烯酮等數十種，導致動物生產性能下降、繁殖力降低、疾病易感性增強和嘔吐、腹瀉、器官壞死等急性和慢性中毒癥狀［4］。世界衛生組織將霉菌毒素納入食品安全體系重點監測內容［5］，我國對食品和飼料中黃曲霉毒素B1等重要毒素規定了最高限量標準［6～10］。傳統的霉菌毒素檢測方法主要有薄層色譜法(TLC)、酶聯免疫法(ELISA)和高效液相色譜法(HPLC)等。這些方法一般只能針對一種或一類結構類似的毒素進行快速篩選、定性或定量檢測［3］。事實上，飼料原料中霉菌毒素污染通常是多種霉菌毒素的聯合污染［11］。因此，開發多種霉菌毒素同步檢測方法具有十分重要的現實意義。由于液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)法集高效分離和多組分定性與定量檢測于一體，成為近年來霉菌毒素多殘留檢測技術的主流方向［12］。如趙孔祥等［13］建立了在線免疫親和凈化LC-MS/MS 檢測中草藥中10 種霉菌毒素的方法，應永飛等［14］建立了多功能凈化柱LC-MS/MS 檢測飼料中14 種霉菌毒素的方法。鄭翠梅等［15］采用LC-TOFMS 同時測定糧食中13 種真菌毒素。但是，上述方法需要專用的前處理設備和成本較高的免疫親和柱，或者需要樣品脫脂，正離子和負離子分別檢測等較為繁瑣的步驟，而且同時檢測霉菌毒素的數量仍然比較有限。本研究采用一種商品化的霉菌毒素多功能凈化柱對樣品進行一次凈化和濃縮，不需要脫脂程序，并且通過優化色譜和質譜條件，實現了正、負離子同時測定，做到一次前處理和一次進樣同時檢測飼料原料中26 種霉菌毒素，具有操作簡單、快速、成本低、定量準確的特點。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-電噴霧電離源-串聯質譜儀(美國Waters 公司);RVC 2-18 臺式離心濃縮儀(德國CHRIST 公司);3K15 高速冷凍離心機(美國Sigma 公司);D37520 高速離心機(美國Kendro 公司);Mycospin 400 多功能凈化柱(ROMER 公司);霉菌毒素空白玉米和豆粕樣品由國家飼料質量監督檢驗中心(北京)惠贈。

標準品及由標準品配制的混合標準溶液儲備液(溶劑為乙腈)濃度信息見表1。乙腈、甲醇、乙酸銨和甲酸(色譜純，美國Fisher 公司);實驗用水為Milli-Q 超純水。混合標準溶液儲備液于-20 ℃保存，使用時分別吸取適量標準儲備液，經離心濃縮儀旋干后，用水-甲醇-甲酸(95∶4.9∶0.1，V/V)溶液溶解，配制成不同濃度的標準系列工作液。

2.2 樣品前處理

稱取5.00 g ± 0.01 g 試樣于50 mL 塑料離心管中，加入20 mL 乙腈-水-甲酸(84∶15.9∶0.1，V/V)進行提取，渦旋混勻1 min，超聲提取1 h，期間每20 min 振蕩1 次。提取完成后，以10000 r/min 離心10 min，取1 mL 上清液于Mycospin 400 多功能凈化柱中，渦旋2 min 使溶液與凈化材料充分混合，打開凈化柱底部出液口，置于配套收集管中，5000 r/min 離心1 min，收集濾液。將濾液置于離心濃縮儀中，60 ℃，1500 r/min 真空旋干。用0.25 mL 水-甲醇-甲酸(95∶4.9∶0.1，V/V)溶解殘渣，渦旋1 min，超聲5 min，13000 r/min 離心10 min，移取上清液于進樣瓶中待測。

2.3 色譜和質譜條件

Acquity UPLC BEH C18色譜柱(100 mm ×2.1 mm，1.7 μm，美國Waters 公司);柱溫40 ℃，流速0.42 mL/min，進樣量10 μL。流動相A 為0.1%甲酸-水，流動相B 為0.1%甲酸-甲醇。梯度洗脫:0 ～2.0 min，95% A;2.0 ～4.0 min，95% ～90% A;4.0 ～12.0 min，90% ～25% A;12.0 ～12.1 min，25% ～1% A;12.1 ～14.0 min，1% A;14.0 ～14.1 min，1% ～95% A;14.1 ～16 min，95% A。

表1 霉菌毒素標準品列表Table 1 Standard compounds of 26 mycotoxins

電噴霧離子源(ESI)，離子源溫度為150 ℃，脫溶劑溫度為450 ℃，脫溶劑氣和錐孔氣均為N2，脫溶劑氣流速為900 L/h，錐孔氣流速為20 L/h。序號1 ～20 霉菌毒素采用正離子(ESI+)監測，序號21 ～26霉菌毒素采用負離子(ESI-)監測方式，毛細管電壓為0.75 kV。采用多反應監測(MRM)方式檢測，監測離子、碰撞能量、錐孔電壓等參數見表2。

3 結果與討論

3.1 儀器條件優化

3.1.1 質譜條件的優化 以甲醇-水(50∶50，V/V)為流動相，采用結合(Combine)進樣方式，對26 種霉菌毒素的質譜條件進行優化，在正、負離子模式下進行全掃描，選擇合適的準分子離子峰和電離方式。根據化合物的響應，設置不同的掃描模式。其中，正電離模式下獲得［M +H］+、［M +NH4］+或［M +Na］+，負電離模式下獲得［M－H］-。結合基質空白和基質標準液的離子掃描圖，進一步優化參數，確定了各種毒素在多反應監測模式(MRM)下信號采集的特征離子對及質譜條件(表2)。

表2 MRM 監測模式下26 種霉菌毒素的質譜優化條件Table 2 Optimized MS/MS parameters of 26 mycotoxins

3.1.2 色譜條件優化 考察了0.1%甲酸-水/0.1%甲酸-甲醇(A)、0.1%甲酸-水/0.1%甲酸-乙腈(B)、0.2 mmol/L 乙酸銨溶液/甲醇(C)、0.2 mmol/L 乙酸銨溶液/乙腈(D)等4 種流動相體系對26 種霉菌毒素的分離效果和峰信號強度。結果表明，26 種毒素在A 和B 流動相體系能夠全部出峰，并且超過半數的霉菌毒素峰信號在A 體系中明顯高于B 體系，如3-AcDON、15-AcDON、HT-2、T-2、VER 等毒素在A 體系中峰信號響應值超過B 體系下5 ～10 倍;NIV，BrERG 等在C 和D 流動相體系中不出峰或有較長拖尾。因此，本研究選擇A 流動相體系。進一步研究發現，洗脫梯度的設定對目標物峰信號強度有很大影響，如OTA 和OTB 保留時間越往后，其峰面積響應值成倍增加，可能與雜質分離度或電離時的溶劑比例有關。在本實驗梯度洗脫條件下，分段采集目標物峰信號，16 min 完成26 種霉菌毒素分離與檢測。圖1 為空白玉米加標的定量離子色譜圖。

3.2 方法性能

3.2.1 基質效應評價 用水-甲醇-甲酸(95∶4.9∶0.1，V/V)配制系列梯度濃度(目標物序號3，4，5，6，7，10，11，12，13，17，19，20 為2，5，10，25和100 ng/mL;目標物序號1，2，8，9，14，15，16，18，21，22，23，24，25，26 為10，25，50，125 和500 ng/mL)混合標樣，同時稱取玉米和豆粕樣品，按照前處理步驟進行提取、凈化和分析，并對空白樣品進行分析，確定不含痕量目標物后，再用空白樣品進樣液稀釋與溶劑標樣濃度相同的系列基質匹配標樣，分別以標樣濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸分析。溶劑標樣和基質匹配標樣的斜率和相關系數(R2)列于表3。溶劑和基質匹配標樣曲線線性良好，R2均大于0.99。基質匹配與溶劑標準曲線斜率的比值可反映出基質效應的強弱。在本實驗中，玉米和豆粕基質對此26 種霉菌毒素均產生了不同程度的基質抑制效應。

圖1 空白玉米基質匹配標準溶液的定量離子色譜圖(3，4，5，6，7，10，11，12，13，17，19，20 濃度為20 μg/kg，其它為100 μg/kg)Fig.1 Chromatograms of quantification transitions of blank maize matrix-matched standard (20 μg/kg for 3，4，5，6，7，10，11，12，13，17，19，20;100 μg/kg for others)

表3 溶劑和基質匹配 標準曲線的斜率和R2Table 3 Slope and R2of solvent and matrix-matched calibration curves

3.2.2 方法的線性范圍與定量限 分別向玉米和豆粕空白樣品提取液中添加適量混合標準溶液，按照2.2 節所述，取1 mL 經Mycospin400 凈化，真空旋干，用0.25 mL 水-甲醇-甲酸(95∶4.9∶0.1，V/V)溶解，配制濃度為1 ～100 μg/kg(目標物序號為:3，4，5，6，7，10，11，12，13，17，19，20，21)和5 ～500 μg/kg(目標物序號為:1，2，8，9，14，15，16，18，22，23，24，25，26)的基質混合標準溶液。根據10 倍信噪比(S/N)確定化合物的方法定量限(LOQ)，以濃度為橫坐標，定量離子對峰面積為縱坐標，進行線性回歸計算，所得R2均大于0.99，結果見表4。

表4 玉米和豆粕基質中26 種霉菌毒素的定量限，線性范圍，平均回收率及相對標準偏差等方法性能參數Table 4 Performance parameters of method such as LOQ，linear range，average recoveries and RSD of 26 target mycotoxins in maize and soybean meal

3.2.3 回收率和精密度實驗 采用玉米和豆粕空白樣品，進行添加回收和精密度實驗。樣品中添加低、中、高3 個濃度梯度的混合標準溶液，每個添加濃度設6 個平行，按本實驗方法進行樣品處理和上機測定，平均回收率為61.9% ～119.5%，相對標準偏差(RSD)為0.8% ～18.6%，結果見表4。

3.3 實際樣品測定

應用本方法對2013 年采自東北和華北地區的76 個玉米和84 個豆粕樣品中26 種霉菌毒素進行檢測。對于飼料衛生標準［7～10］規定了最高限量的4 種霉菌毒素，AFB1，T-2，DON 和ZEN 在玉米樣品中檢出率分別為7.9%，0%，76.3%和39.5%，在豆粕樣品中的檢出率分別為4.8%，0%，66.7%和38.1%。其中，AFB1和ZEN 在玉米、豆粕樣品中的超標率均為0。由于飼料衛生標準沒有對玉米和豆粕中DON 作出限量規定，參考配合飼料中DON 最高限量1000 μg/kg，則13.1%的玉米樣品和2.4%的豆粕樣品中DON 含量超過1000 μg/kg。其它尚沒有限量標準的霉菌毒素除ERG 未檢出外，其它毒素均有不同程度的檢出。

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