液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定飼料原料中26種霉菌毒素

王瑞國(guó) 蘇曉鷗 程芳芳 王培龍 樊霞 張維

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100081)

1 引言

霉菌毒素(Mycotoxins)是由某些霉菌在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物［1］，飼料原料特別易于被各種霉菌毒素污染［2］，從而對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)帶來(lái)各種危害。目前，已經(jīng)確認(rèn)化學(xué)結(jié)構(gòu)的霉菌毒素達(dá)400多種［3］。其中，對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)影響較大的主要有黃曲霉毒素、嘔吐毒素、T-2 毒素和玉米赤霉烯酮等數(shù)十種，導(dǎo)致動(dòng)物生產(chǎn)性能下降、繁殖力降低、疾病易感性增強(qiáng)和嘔吐、腹瀉、器官壞死等急性和慢性中毒癥狀［4］。世界衛(wèi)生組織將霉菌毒素納入食品安全體系重點(diǎn)監(jiān)測(cè)內(nèi)容［5］，我國(guó)對(duì)食品和飼料中黃曲霉毒素B1等重要毒素規(guī)定了最高限量標(biāo)準(zhǔn)［6～10］。傳統(tǒng)的霉菌毒素檢測(cè)方法主要有薄層色譜法(TLC)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)和高效液相色譜法(HPLC)等。這些方法一般只能針對(duì)一種或一類(lèi)結(jié)構(gòu)類(lèi)似的毒素進(jìn)行快速篩選、定性或定量檢測(cè)［3］。事實(shí)上，飼料原料中霉菌毒素污染通常是多種霉菌毒素的聯(lián)合污染［11］。因此，開(kāi)發(fā)多種霉菌毒素同步檢測(cè)方法具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。由于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法集高效分離和多組分定性與定量檢測(cè)于一體，成為近年來(lái)霉菌毒素多殘留檢測(cè)技術(shù)的主流方向［12］。如趙孔祥等［13］建立了在線免疫親和凈化LC-MS/MS 檢測(cè)中草藥中10 種霉菌毒素的方法，應(yīng)永飛等［14］建立了多功能凈化柱LC-MS/MS 檢測(cè)飼料中14 種霉菌毒素的方法。鄭翠梅等［15］采用LC-TOFMS 同時(shí)測(cè)定糧食中13 種真菌毒素。但是，上述方法需要專(zhuān)用的前處理設(shè)備和成本較高的免疫親和柱，或者需要樣品脫脂，正離子和負(fù)離子分別檢測(cè)等較為繁瑣的步驟，而且同時(shí)檢測(cè)霉菌毒素的數(shù)量仍然比較有限。本研究采用一種商品化的霉菌毒素多功能凈化柱對(duì)樣品進(jìn)行一次凈化和濃縮，不需要脫脂程序，并且通過(guò)優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件，實(shí)現(xiàn)了正、負(fù)離子同時(shí)測(cè)定，做到一次前處理和一次進(jìn)樣同時(shí)檢測(cè)飼料原料中26 種霉菌毒素，具有操作簡(jiǎn)單、快速、成本低、定量準(zhǔn)確的特點(diǎn)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-電噴霧電離源-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters 公司);RVC 2-18 臺(tái)式離心濃縮儀(德國(guó)CHRIST 公司);3K15 高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma 公司);D37520 高速離心機(jī)(美國(guó)Kendro 公司);Mycospin 400 多功能凈化柱(ROMER 公司);霉菌毒素空白玉米和豆粕樣品由國(guó)家飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(北京)惠贈(zèng)。

標(biāo)準(zhǔn)品及由標(biāo)準(zhǔn)品配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液(溶劑為乙腈)濃度信息見(jiàn)表1。乙腈、甲醇、乙酸銨和甲酸(色譜純，美國(guó)Fisher 公司);實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q 超純水。混合標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液于-20 ℃保存，使用時(shí)分別吸取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，經(jīng)離心濃縮儀旋干后，用水-甲醇-甲酸(95∶4.9∶0.1，V/V)溶液溶解，配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

2.2 樣品前處理

稱(chēng)取5.00 g ± 0.01 g 試樣于50 mL 塑料離心管中，加入20 mL 乙腈-水-甲酸(84∶15.9∶0.1，V/V)進(jìn)行提取，渦旋混勻1 min，超聲提取1 h，期間每20 min 振蕩1 次。提取完成后，以10000 r/min 離心10 min，取1 mL 上清液于Mycospin 400 多功能凈化柱中，渦旋2 min 使溶液與凈化材料充分混合，打開(kāi)凈化柱底部出液口，置于配套收集管中，5000 r/min 離心1 min，收集濾液。將濾液置于離心濃縮儀中，60 ℃，1500 r/min 真空旋干。用0.25 mL 水-甲醇-甲酸(95∶4.9∶0.1，V/V)溶解殘?jiān)瑴u旋1 min，超聲5 min，13000 r/min 離心10 min，移取上清液于進(jìn)樣瓶中待測(cè)。

2.3 色譜和質(zhì)譜條件

Acquity UPLC BEH C18色譜柱(100 mm ×2.1 mm，1.7 μm，美國(guó)Waters 公司);柱溫40 ℃，流速0.42 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。流動(dòng)相A 為0.1%甲酸-水，流動(dòng)相B 為0.1%甲酸-甲醇。梯度洗脫:0 ～2.0 min，95% A;2.0 ～4.0 min，95% ～90% A;4.0 ～12.0 min，90% ～25% A;12.0 ～12.1 min，25% ～1% A;12.1 ～14.0 min，1% A;14.0 ～14.1 min，1% ～95% A;14.1 ～16 min，95% A。

表1 霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品列表Table 1 Standard compounds of 26 mycotoxins

電噴霧離子源(ESI)，離子源溫度為150 ℃，脫溶劑溫度為450 ℃，脫溶劑氣和錐孔氣均為N2，脫溶劑氣流速為900 L/h，錐孔氣流速為20 L/h。序號(hào)1 ～20 霉菌毒素采用正離子(ESI+)監(jiān)測(cè)，序號(hào)21 ～26霉菌毒素采用負(fù)離子(ESI-)監(jiān)測(cè)方式，毛細(xì)管電壓為0.75 kV。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)方式檢測(cè)，監(jiān)測(cè)離子、碰撞能量、錐孔電壓等參數(shù)見(jiàn)表2。

3 結(jié)果與討論

3.1 儀器條件優(yōu)化

3.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 以甲醇-水(50∶50，V/V)為流動(dòng)相，采用結(jié)合(Combine)進(jìn)樣方式，對(duì)26 種霉菌毒素的質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描，選擇合適的準(zhǔn)分子離子峰和電離方式。根據(jù)化合物的響應(yīng)，設(shè)置不同的掃描模式。其中，正電離模式下獲得［M +H］+、［M +NH4］+或［M +Na］+，負(fù)電離模式下獲得［M－H］-。結(jié)合基質(zhì)空白和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液的離子掃描圖，進(jìn)一步優(yōu)化參數(shù)，確定了各種毒素在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)下信號(hào)采集的特征離子對(duì)及質(zhì)譜條件(表2)。

表2 MRM 監(jiān)測(cè)模式下26 種霉菌毒素的質(zhì)譜優(yōu)化條件Table 2 Optimized MS/MS parameters of 26 mycotoxins

3.1.2 色譜條件優(yōu)化 考察了0.1%甲酸-水/0.1%甲酸-甲醇(A)、0.1%甲酸-水/0.1%甲酸-乙腈(B)、0.2 mmol/L 乙酸銨溶液/甲醇(C)、0.2 mmol/L 乙酸銨溶液/乙腈(D)等4 種流動(dòng)相體系對(duì)26 種霉菌毒素的分離效果和峰信號(hào)強(qiáng)度。結(jié)果表明，26 種毒素在A 和B 流動(dòng)相體系能夠全部出峰，并且超過(guò)半數(shù)的霉菌毒素峰信號(hào)在A 體系中明顯高于B 體系，如3-AcDON、15-AcDON、HT-2、T-2、VER 等毒素在A 體系中峰信號(hào)響應(yīng)值超過(guò)B 體系下5 ～10 倍;NIV，BrERG 等在C 和D 流動(dòng)相體系中不出峰或有較長(zhǎng)拖尾。因此，本研究選擇A 流動(dòng)相體系。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，洗脫梯度的設(shè)定對(duì)目標(biāo)物峰信號(hào)強(qiáng)度有很大影響，如OTA 和OTB 保留時(shí)間越往后，其峰面積響應(yīng)值成倍增加，可能與雜質(zhì)分離度或電離時(shí)的溶劑比例有關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)梯度洗脫條件下，分段采集目標(biāo)物峰信號(hào)，16 min 完成26 種霉菌毒素分離與檢測(cè)。圖1 為空白玉米加標(biāo)的定量離子色譜圖。

3.2 方法性能

3.2.1 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià) 用水-甲醇-甲酸(95∶4.9∶0.1，V/V)配制系列梯度濃度(目標(biāo)物序號(hào)3，4，5，6，7，10，11，12，13，17，19，20 為2，5，10，25和100 ng/mL;目標(biāo)物序號(hào)1，2，8，9，14，15，16，18，21，22，23，24，25，26 為10，25，50，125 和500 ng/mL)混合標(biāo)樣，同時(shí)稱(chēng)取玉米和豆粕樣品，按照前處理步驟進(jìn)行提取、凈化和分析，并對(duì)空白樣品進(jìn)行分析，確定不含痕量目標(biāo)物后，再用空白樣品進(jìn)樣液稀釋與溶劑標(biāo)樣濃度相同的系列基質(zhì)匹配標(biāo)樣，分別以標(biāo)樣濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析。溶劑標(biāo)樣和基質(zhì)匹配標(biāo)樣的斜率和相關(guān)系數(shù)(R2)列于表3。溶劑和基質(zhì)匹配標(biāo)樣曲線線性良好，R2均大于0.99。基質(zhì)匹配與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值可反映出基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱。在本實(shí)驗(yàn)中，玉米和豆粕基質(zhì)對(duì)此26 種霉菌毒素均產(chǎn)生了不同程度的基質(zhì)抑制效應(yīng)。

圖1 空白玉米基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的定量離子色譜圖(3，4，5，6，7，10，11，12，13，17，19，20 濃度為20 μg/kg，其它為100 μg/kg)Fig.1 Chromatograms of quantification transitions of blank maize matrix-matched standard (20 μg/kg for 3，4，5，6，7，10，11，12，13，17，19，20;100 μg/kg for others)

表3 溶劑和基質(zhì)匹配 標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和R2Table 3 Slope and R2of solvent and matrix-matched calibration curves

3.2.2 方法的線性范圍與定量限 分別向玉米和豆粕空白樣品提取液中添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照2.2 節(jié)所述，取1 mL 經(jīng)Mycospin400 凈化，真空旋干，用0.25 mL 水-甲醇-甲酸(95∶4.9∶0.1，V/V)溶解，配制濃度為1 ～100 μg/kg(目標(biāo)物序號(hào)為:3，4，5，6，7，10，11，12，13，17，19，20，21)和5 ～500 μg/kg(目標(biāo)物序號(hào)為:1，2，8，9，14，15，16，18，22，23，24，25，26)的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。根據(jù)10 倍信噪比(S/N)確定化合物的方法定量限(LOQ)，以濃度為橫坐標(biāo)，定量離子對(duì)峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸計(jì)算，所得R2均大于0.99，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 玉米和豆粕基質(zhì)中26 種霉菌毒素的定量限，線性范圍，平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差等方法性能參數(shù)Table 4 Performance parameters of method such as LOQ，linear range，average recoveries and RSD of 26 target mycotoxins in maize and soybean meal

3.2.3 回收率和精密度實(shí)驗(yàn) 采用玉米和豆粕空白樣品，進(jìn)行添加回收和精密度實(shí)驗(yàn)。樣品中添加低、中、高3 個(gè)濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)添加濃度設(shè)6 個(gè)平行，按本實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行樣品處理和上機(jī)測(cè)定，平均回收率為61.9% ～119.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.8% ～18.6%，結(jié)果見(jiàn)表4。

3.3 實(shí)際樣品測(cè)定

應(yīng)用本方法對(duì)2013 年采自東北和華北地區(qū)的76 個(gè)玉米和84 個(gè)豆粕樣品中26 種霉菌毒素進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)［7～10］規(guī)定了最高限量的4 種霉菌毒素，AFB1，T-2，DON 和ZEN 在玉米樣品中檢出率分別為7.9%，0%，76.3%和39.5%，在豆粕樣品中的檢出率分別為4.8%，0%，66.7%和38.1%。其中，AFB1和ZEN 在玉米、豆粕樣品中的超標(biāo)率均為0。由于飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有對(duì)玉米和豆粕中DON 作出限量規(guī)定，參考配合飼料中DON 最高限量1000 μg/kg，則13.1%的玉米樣品和2.4%的豆粕樣品中DON 含量超過(guò)1000 μg/kg。其它尚沒(méi)有限量標(biāo)準(zhǔn)的霉菌毒素除ERG 未檢出外，其它毒素均有不同程度的檢出。

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