免疫親和柱凈化-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定海洋生物中河豚毒素

嚴(yán)忠雍 張小軍 李奇富 王瑩 柳家鵬龍舉 祝銀 楊會(huì)成

1(浙江省海洋水產(chǎn)研究所，舟山316021)

2(江蘇美正生物科技有限公司，無(wú)錫214135)

3(浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，舟山316021)

4(浙江省海洋開發(fā)研究院，舟山316021)

1 引言

河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)是一種天然海洋生物神經(jīng)毒素，分布廣泛，主要存在于河豚魚中，圓尾鱟、藍(lán)環(huán)章魚、螺類等其它海洋生物中也有存在。河豚毒素毒性極強(qiáng)，食用0.5 mg 就可致人死亡，其帶正電荷的胍基能伸入鈉通道的離子選擇過(guò)濾器，和通道內(nèi)壁上的游離羧基結(jié)合，阻礙Na+進(jìn)入，從而抑制神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)，使人感覺神經(jīng)麻痹，四肢癱瘓，呼吸困難，最后因呼吸抑制而死亡［1～4］。我國(guó)每年都有因食帶有TTX 的海洋生物而導(dǎo)致中毒的事件發(fā)生。鑒于河豚毒素的嚴(yán)重危害，有必要建立一種簡(jiǎn)便、快速有效檢測(cè)河豚毒素的方法。目前，河豚毒素的檢測(cè)方法有生物測(cè)定法［5］、高效液相色譜法(HPLC)［6，7］、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS)［8～11］及酶聯(lián)免疫法(ELISA)［12］等。其中，生物測(cè)定法一般需要專門動(dòng)物，適用性差，且操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力重復(fù)性差;酶聯(lián)免疫法雖特異性強(qiáng)，但酶聯(lián)免疫反應(yīng)耗時(shí)長(zhǎng)，操作難度較大;液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度高，但現(xiàn)有的文獻(xiàn)方法檢出限偏高，前處理復(fù)雜，且采用的固相萃取技術(shù)凈化樣品不理想、易受基質(zhì)干擾，回收率低。免疫親和柱(IAC)是一種基于抗原抗體反應(yīng)的新型層析柱，利用生物大分子具有對(duì)一類生物大分子特異識(shí)別和可逆結(jié)合的特性制作而成，具有獨(dú)特的選擇專一性和良好的吸附凈化性能。目前，尚未見以免疫親和柱作為前處理凈化手段檢測(cè)河豚毒素的相關(guān)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的高靈敏性和精確性，利用免疫親和柱的獨(dú)特選擇識(shí)別性，建立一種快速、簡(jiǎn)便、高效測(cè)定海洋生物中河豚毒素的分析方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

ACQUITY 超高效液相色譜-質(zhì)譜儀Quattro Premier XE(美國(guó)Waters 公司);MS2 漩渦混合器(德國(guó)IKA 公司);N-EVAP-112 氮吹儀(美國(guó)Organomation 公司);Centrifuge5810 高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司);12 通道固相萃取裝置(美國(guó)Supelco 公司)。

TTX 標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98.0%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司);TTX 免疫親和柱(柱容量3 mL，北京華安麥科生物技術(shù)有限公司);乙腈、甲醇(色譜純，德國(guó)Merck 公司);乙酸銨、甲酸(美國(guó)Sigma 公司);乙酸、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、NaCl、NaOH(上海國(guó)藥集團(tuán));實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

2.2 溶液的配制

TTX 標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取5.00 mg TTX 標(biāo)準(zhǔn)品，用0.1%甲酸-乙腈(1∶1，V/V)溶液溶解并定容至50 mL，4 ℃避光保存，保存期限為6 個(gè)月;使用時(shí)逐級(jí)用0.1%甲酸-乙腈溶液(1∶ 1，V/V)稀釋至100 μg/L。磷酸鹽緩沖液(PBS):分別稱取Na2HPO4·12H2O 6.45 g，NaH2PO2·2H2O 1.09 g，NaCl 4.25 g，用水溶解并定容至500 mL。

2.3 色譜及質(zhì)譜條件

色譜柱:ACQUITY UPLC BEH Amide 柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm);樣品室溫度10 ℃;柱溫40 ℃;進(jìn)樣體積10 μL;流速0.3 mL/min;流動(dòng)相A 為含0.1%甲酸的5 mmol/L 乙酸銨溶液，B 為乙腈，梯度洗脫:0 ～1.5 min，5% ～80% A;1.5 ～3.0 min，80% A;3.0 ～3.5 min，80% ～5% A;3.5 ～5 min，5% A。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源，正離子掃描(ESI +);檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);毛細(xì)管電壓:3.0 kV;離子源溫度:110 ℃;脫溶劑氣溫度:350 ℃;錐孔氣流量:50 L/h;脫溶劑氣流量:600 L/h;錐孔電壓、碰撞能量、分析物母離子及子離子等質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)條件如表1 所示。

表1 河豚毒素的質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)條件Table 1 Conditions of multiple reaction monitoring for tetrodotoxin (TTX)

2.4 樣品處理

2.4.1 樣品提取 稱取已充分均質(zhì)樣品2.00 g 于50 mL 具塞離心管中，加入10 mL 含有1%乙酸的甲醇溶液，渦旋振蕩2 min，60 ℃水浴超聲提取15 min，冷卻至室溫后，6000 r/min 離心5 min。移取5 mL 上清液至另一個(gè)50 mL 離心管中，加入20 mL PBS 溶液稀釋，用1 mol/L NaOH 調(diào)至pH 7 ～8，待凈化。

2.4.2 免疫親和柱凈化 取出免疫親和柱，待回至室溫，去掉親和柱堵頭，放出柱內(nèi)保存液后，上樣品液。上樣結(jié)束后，用8 mL 水淋洗親和柱，擠干柱內(nèi)殘留液，并棄去以上全部流出液，最后用4 mL 含有1%乙酸的甲醇溶液洗脫，收集的洗脫液于60℃氮?dú)獯蹈?，? mL 流動(dòng)相溶解并定容，經(jīng)0.22 μm 濾膜后供液相色譜-質(zhì)譜分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜與質(zhì)譜條件選擇

TTX 由于親水性和極性較強(qiáng)，在一般的反向色譜柱上不易保留，而ACQUITY UPLC BEH Amide 色譜柱作為專用于強(qiáng)極性化合物分析的親水色譜柱，對(duì)TTX 保留性強(qiáng)，且具有較好的色譜峰形，滿足TTX液相色譜分析的需要。乙酸銨溶液能促進(jìn)TTX 胍電離，并為陽(yáng)離子的形成提供了質(zhì)子來(lái)源，提高TTX離子化效率;甲酸能通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH 達(dá)到合適的分離效果，改善色譜峰形。本實(shí)驗(yàn)研究比較了多組不同體積分?jǐn)?shù)甲酸及不同濃度乙酸銨溶液對(duì)色譜分析的影響。結(jié)果表明，以0.1%甲酸的5 mmol/L 乙酸銨溶液與乙腈為流動(dòng)相具有良好的色譜分離效果，且峰形尖銳對(duì)稱。

TTX 分子結(jié)構(gòu)中具有帶正電荷的胍基，本實(shí)驗(yàn)選擇在正離子掃描模式下用蠕動(dòng)泵以3.0 mg/L 的TTX 標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行流動(dòng)注射分析，對(duì)質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜掃描分析，得到TTX 的分子離子，調(diào)試選擇最佳錐孔電壓和毛細(xì)管電壓，其中［M+H］+(m/z 320)豐度最高，從而可選擇離子m/z 320作為母離子進(jìn)行檢測(cè)，如圖1 所示。對(duì)分析物離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，獲取碎片離子信息，并對(duì)碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，見表1。

3.2 提取試劑的選擇

TTX 是一種氨基全氫喹唑啉型化合物，只溶于酸性水或有機(jī)溶液。本實(shí)驗(yàn)比較了乙腈和甲醇對(duì)TTX 的提取效率。乙腈作為常用的提取試劑，提取效率較好，但毒性較大;考慮到甲醇能迅速穿透組織，沉淀蛋白質(zhì)，并具有脫水性，是提取TTX 的良好試劑。為考察TTX 提取所需的合適酸度，通過(guò)添加不同體積分?jǐn)?shù)的乙酸獲取不同酸度的甲醇，比較不同酸度甲醇下提取得到的5 μg/L TTX 峰面積，結(jié)果如圖2 所示。當(dāng)提取試劑中乙酸體積分?jǐn)?shù)小于1%時(shí)，提取得到的TTX 峰面積隨乙酸的體積分?jǐn)?shù)增加而增大;當(dāng)體積分?jǐn)?shù)大于1%后，峰面積基本保持不變，而過(guò)量的乙酸不利于調(diào)節(jié)樣品液pH 值，因此選擇含1%乙酸甲醇作為TTX 提取試劑。

圖1 TTX 一級(jí)質(zhì)譜全掃描圖Fig.1 MS scan spectra of TTX

3.3 免疫親和柱條件優(yōu)化

免疫親和柱的親和結(jié)合作用與樣品液的pH 值直接相關(guān)，不適宜的pH 值會(huì)使親和作用減弱或破壞。本實(shí)驗(yàn)采用HCl 和NaOH 調(diào)節(jié)樣品液pH 值，通過(guò)比較不同pH 值下TTX 的回收率，考察不同pH值下免疫親和柱的親和作用能力，結(jié)果如圖3 所示。當(dāng)pH =7 ～8 時(shí)，親和作用能力最佳，TTX 回收率最高;當(dāng)pH ＜6.5 或pH ＞9 時(shí)，親和能力明顯減弱，由此確定pH=7 ～8 時(shí)為TTX 免疫親和柱的最適宜pH 值。當(dāng)使用8 mL 水淋洗親和柱時(shí)，雜質(zhì)可基本除去，而TTX 未被洗脫下來(lái);當(dāng)4 mL 含有1%乙酸甲醇洗脫親和柱時(shí)，TTX 幾乎已完全洗脫，回收率也趨于穩(wěn)定。因此本實(shí)驗(yàn)采用8 mL 水作為淋洗液，4 mL 含有1%乙酸甲醇作為洗脫液。

圖2 提取試劑酸度對(duì)TTX 提取效果的影響Fig.2 Effect of extraction reagent acidity on TTX extraction

本實(shí)驗(yàn)還比較了MCX 柱、C18柱、SCX 柱與免疫親和柱對(duì)海洋生物的凈化效果，并考察4 種層析柱對(duì)TTX 回收率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，免疫親和柱對(duì)海洋生物樣品的凈化效果最好，目標(biāo)峰能與雜峰有效分離，且響應(yīng)強(qiáng)度高，回收率好，如圖4 所示。

圖3 樣品液pH 值對(duì)樣品中TTX 的回收率的影響Fig.3 Influence of pH on the recoveries of TTx in sample solution

3.4 線性范圍和定量限

用TTX 標(biāo)準(zhǔn)使用液配制濃度為0.3，1.0，2.0，5.0，10.0 和20.0 μg/L 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，峰面積-TTX 濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y =72.2835x +13.5344(R2=0.9972)，TTX 在0.3 ～20.0 μg/L 范圍內(nèi)線性良好。以3 倍信噪比確定本方法的檢出限(LOD)為0.1 μg/kg，以10 倍信噪比確定本方法的定量限(LOQ)為0.3 μg/kg，如圖5 所示。本方法較文獻(xiàn)［10，11］檢出限更低，靈敏度提高了3 ～4 倍，適用于海洋生物中TTX 的檢測(cè)。

圖4 10 μg/kg 加標(biāo)陰性樣品經(jīng)免疫親和柱凈化后的MRM 圖譜(a.定量離子對(duì);b.定性離子對(duì))Fig.4 MRM chromatograms of 10 μg/kg spiked sample cleaned up by IAC column(a.quantitative ion pair;b.qualitative ion pair)

圖5 TTX 定量限的MRM 圖(a.定量離子對(duì);b.定性離子對(duì))Fig.5 MRM chromatograms of quantification limit (a.quantitative ion pair;b.qualitative ion pair)

3.5 回收率和精密度

準(zhǔn)確稱取2.00 g 陰性對(duì)蝦樣品，添加水平為0.30，1.50 和5.00 μg/kg 的TTX 標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6 次，計(jì)算回收率和精密度，結(jié)果見表2。TTX 在0.30 ～5.00 μg/kg添加水平的平均回收率88.7% ～102.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.0% ～6.4%。

3.6 實(shí)際樣品分析

采用本方法對(duì)鷹爪蝦、對(duì)蝦、海鰻、荔枝螺、單齒螺、織紋螺、槍烏賊、曼氏無(wú)針烏賊、貽貝、花蛤、三疣梭子蟹、細(xì)點(diǎn)圓趾蟹、圓尾鱟等共計(jì)13 種樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中織紋螺、花蛤、圓尾鱟樣品中檢出TTX，濃度依次為56.4，2.43 和174 μg/kg。分析結(jié)果表明，本方法采用免疫親和柱凈化、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)海洋生物中河豚毒素，靈敏度高，精密度和回收率均能滿足檢測(cè)分析的要求。

表2 TTX 的標(biāo)準(zhǔn)加入回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 Recoveries of standard addition and relative standard deviation for TTX (n=6)

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