眼鏡蛇長鏈神經毒素鎮痛效應及可能機制

彭建明，蘇蘭娣，羅 雪，葉記林，于有江

（揚州職業大學醫學院，江蘇揚州225009）

眼鏡蛇長鏈神經毒素鎮痛效應及可能機制

彭建明，蘇蘭娣，羅 雪，葉記林，于有江

（揚州職業大學醫學院，江蘇揚州225009）

目的探究眼鏡蛇長鏈神經毒素（CBT）的鎮痛作用及可能機制。方法采用在體細胞外記錄方法記錄慢性炎癥痛模型大鼠脊髓背角神經元的痛誘發放電，分別對六組實驗大鼠注射生理鹽水（5 μL）、CBT（20、40、80 ng/kg）、阿托品（2 mg/kg）、阿托品（2 mg/kg）+CBT（40 ng/kg），觀察不同含量CBT對脊髓背角神經元痛誘發放電的影響，同時觀察膽堿能受體拮抗劑阿托品能否翻轉其鎮痛效應。結果不同含量CBT均可以顯著抑制慢性炎癥痛大鼠脊髓背角神經元的痛誘發放電，各含量CBT組放電頻率與生理鹽水組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），且該效應可被阿托品所阻斷，阿托品+CBT組在20、30、40、50、60 min放電頻率與CBT（40 ng/kg）組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論CBT具有顯著的鎮痛效應，該效應有一定的劑量依賴性，膽堿能受體系統參與了其鎮痛過程。

眼鏡蛇毒液類； 眼鏡蛇屬； 神經毒素類； 鎮痛

疼痛是一種伴隨組織損傷的復合感覺，常與心理活動、運動反射、情緒等交織在一起，往往具有個體差異、令人不悅的感覺和情緒上的感受。疼痛的生物學意義具有雙重特點：一方面是機體不可或缺的一種特殊保護功能，出現痛覺的防御反應，進而警告機體及時采取措施來避免進一步的傷害，減輕病痛；另一方面，其又可形成病理性的慢性疼痛綜合征，許多劇烈的持續性疼痛對人體造成嚴重的折磨，給人類造成的苦難和傷害也是不可估量的。目前雖然有手術、針刺、藥物等減輕痛覺感受的方法，但均有其局限性，因此，尋求一種有效的鎮痛方法一直是患者和臨床工作者的述求。

祖國醫學很早就有利用蛇毒為人類服務的記載。蛇毒是一種由蛇毒腺分泌的復雜混合物，按其作用部位與方式主要分為2種基本類型：一種是作用于神經-肌肉接頭的接頭前膜，進而抑制突觸前神經元乙酰膽堿的釋放，故稱為突觸前神經毒素，也稱為β-神經毒素；另一種是作用于神經-肌肉接頭處的接頭后膜，與接頭后膜上的膽堿能受體結合后抑制乙酰膽堿的作用，進而可引起肌肉松弛，稱為突觸后神經毒素，也稱為α-神經毒素。這2種蛇毒神經毒素都阻斷神經-肌肉接頭處的興奮傳遞，引起肌肉麻痹、松弛。有研究發現，眼鏡蛇蛇毒神經毒素除了有抗腫瘤、抗炎、治療心腦血管和神經系統疾病的作用外，還具有鎮痛作用[1-4]。有研究結果顯示，在小鼠的扭體法和熱板法的行為測試中，分離出來的眼鏡蛇長鏈神經毒素（cobratoxin，CBT）可產生顯著的鎮痛效應，并能夠明顯抑制慢性炎癥大鼠的痛反應[5-6]。因此，本實驗主要采用在體細胞外記錄的方法觀察CBT對慢性炎癥痛模型大鼠脊髓背角神經元單位放電的影響，同時分析其鎮痛效應與膽堿能受體的關系，以探討CBT鎮痛效應的可能機制，為臨床開發蛇毒作為鎮痛藥物提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 無特定病原體SPF級雄性SD大鼠48只，體質量220～320 g，由揚州大學動物實驗中心提供。12 h明暗交替光照，給予充足的水源和飼料。根據實驗中注射試劑不同，將建立模型后選擇出來的實驗大鼠隨機分為六組：生理鹽水組、不同含量CBT組（20、40、80 ng/kg）、阿托品組、阿托品+CBT組，每組8只。實驗所用阿托品購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 建立慢性炎癥痛模型 在每只健康大鼠的右側后肢足底皮下注射完全弗氏佐劑（complete Freund′s adjuvant，CFA）0.15 mL，注射后局部炎性反應明顯。選取注射CFA 7 d后，皮溫升高，右足紅腫，右側后肢踝關節腫脹，經行為學檢測痛覺過敏的大鼠作為實驗對象。生理鹽水組：在每只健康大鼠右側后肢相同部位注射同樣容積的生理鹽水作為對照，1周后未見紅腫、皮溫升高及痛覺過敏等現象。

1.2.2 動物準備 實驗用健康成年雄性SD大鼠，體質量220～320 g，4%水合氯醛（400 mg/kg）腹腔注射麻醉，氣管插管，固定動物于立體定位儀上。大鼠脊柱固定，于腰膨大T13至L1處行椎板切開術，切開脊髓的硬脊膜與蛛網膜，使暴露的脊髓與周圍組織形成一個小池。游離同側后肢坐骨神經約1.5 cm，并將刺激電極置于游離出坐骨神經上。在大鼠坐骨神經暴露處定時滴加液體石蠟，以防坐骨神經干燥。術后用三碘季胺酚（40 mg/kg）制動，用溫控儀將動物肛溫維持在37.5℃左右，在維持麻醉下進行實驗，分別對六組實驗大鼠注射生理鹽水（5 μL）、CBT（20、40、80 ng/kg）、阿托品（2 mg/kg）、阿托品（2 mg/kg）+CBT（40 ng/kg）。隨時觀察大鼠肢端皮膚色澤，同時連續監測大鼠心電圖，如若異常立即終止實驗。

1.2.3 記錄實驗數據 穩定記錄到脊髓背角廣動力范圍（WDR）神經元放電5 min后開始實驗，電刺激坐骨神經作為傷害性刺激，以給予電刺激后WDR神經元5 s的放電頻率（spikes/s）為指標，分別記錄給藥前后的放電頻率，以給藥前傷害性刺激放電頻率為100%，給藥后的各時間點放電頻率折算成相對值。

1.3 統計學處理 應用Powerlab軟件（Chart V5.3）采集放電圖形并測量痛誘發放電頻率。應用SPSS10.0統計軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同含量CBT對炎癥模型大鼠脊髓背角WDR神經元痛誘發放電的影響 在大鼠脊髓表面滴注不同含量CBT對佐劑性炎癥大鼠脊髓背角WDR神經元的痛誘發放電均有顯著的抑制效應。CBT組（20 ng/kg）在給藥后30 min開始產生明顯抑制作用，而40、80 ng/kg CBT組在給藥后20 min開始產生顯著抑制作用，各組放電頻率與生理鹽水組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。而且隨著CBT含量增加，對脊髓背角WDR神經元痛誘發放電抑制率增高，且不同含量CBT組對脊髓背角WDR神經元痛誘發放電的抑制率隨時間持續性增高。見圖1。

2.2 阿托品對CBT在炎癥模型大鼠脊髓背角WDR神經元痛誘發放電的影響 阿托品組大鼠預先腹腔注射阿托品2 mg/kg 2 h后，其對炎癥大鼠脊髓背角WDR神經元的痛誘發放電頻率與生理鹽水組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。阿托品+CBT組在給藥20、30、40、50、60 min后均顯著降低了對脊髓背角WDR神經元痛誘發放電的抑制，放電頻率與CBT（40 ng/kg）組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖1 不同含量CBT對炎癥模型大鼠脊髓背角WDR神經元痛誘發放電的影響

圖2 阿托品對CBT在炎癥模型大鼠脊髓背角WDR神經元痛誘發放電的影響

3 討 論

痛覺信號在上行傳導的過程中，在中樞神經系統的每一個水平，都具有一定的整合功能。以往對眼鏡蛇神經毒素在慢性炎癥疼痛的鎮痛作用鮮有報道。Liu等[7]用CFA建造模型（造模）引起大鼠持續炎癥疼痛并出現痛覺過敏，在造模成功后第11天開始腹腔注射CBT能顯著抑制佐劑性炎癥大鼠的機械痛敏和熱痛敏，說明CBT具有抗炎、減輕疼痛作用。近年來，隨著對慢性炎癥疼痛機制探究的深入，發現脊髓背角神經元與慢性炎癥疼痛的發生和發展存在著緊密關系。大量的實驗研究及臨床案例均已證實眼鏡蛇神經毒素具有鎮痛作用[8-10]，但對于具體鎮痛機制的研究報道較少。因此，本實驗是觀察不同濃度CBT對慢性炎癥痛模型大鼠脊髓背角的痛誘發放電的影響，發現不同濃度CBT對慢性炎癥痛模型大鼠脊髓背角的痛誘發放電均具有顯著抑制效應，且具有一定的劑量依賴性，證實了其具有顯著鎮痛效果。

在痛覺信息傳遞及調制的生理過程中，神經遞質阿片肽、5-羥色胺、乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）、一氧化氮、腺苷三磷酸、腺苷、降鈣素基因相關肽等均參與了痛覺的調制。其中，ACh是最早被確定的神經遞質之一，其廣泛分布于大腦皮層、腦干和脊髓等部位。有文獻證明，擬膽堿類藥參與了針刺鎮痛過程，且鎮痛部位在中樞神經而不是在外周神經[11]。針刺鎮痛時中樞ACh合成釋放和更新率都升高，膽堿酯酶的活性提高；應用藥物使ACh在一定部位的積聚可使鎮痛效應加強，反之減弱。目前關注的蛇毒神經毒素的鎮痛部位主要位于中樞。腦室、中腦導水管周圍灰質微量注射蛇毒神經毒素也可產生顯著的鎮痛效應。蛇毒的鎮痛作用能在熱板法的實驗（熱板法的行為反應是一個脊髓以上高級中樞整合的反應）中很好地反映出來，但有研究顯示，在大鼠的甩尾實驗中，蛇毒神經毒素無顯著鎮痛效應，說明蛇毒的鎮痛部位僅限于脊髓以上的高位水平，但也不能完全排除外周鎮痛的可能性[12]。

蛇毒神經毒素鎮痛作用時間長、效價高，且連續用藥后不耐受，明顯優于阿片肽及其衍生物，屬于麻醉性鎮痛藥，CBT鎮痛作用是否與阿片肽受體有關尚有待于進一步研究。有研究顯示，蛇毒神經毒素的鎮痛作用與中樞M膽堿能系統興奮有關[13-14]。為進一步揭示CBT對慢性炎癥大鼠鎮痛的可能機制，本實驗使用了膽堿能受體拮抗劑阿托品，發現阿托品可以翻轉CBT對慢性炎癥大鼠的脊髓背角神經元痛誘發放電的抑制作用，提示阿托品可以顯著翻轉CBT的鎮痛作用，從而表明CBT的鎮痛作用可能與膽堿能受體系統有關，至于其確切機制及其與阿片肽的關系尚有待于進一步研究證實。

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Analgesic effect of cobratoxin and its possible mechanism

Peng Jianming，Su Landi，Luo Xue，Ye Jilin，Yu Youjiang
（Medical College of Yangzhou Polytechnic College，Yangzhou，Jiangsu 225009，China）

ObjectiveTo investigate the analgesic effect of cobratoxin（CBT）and its possible mechanisms.MethodsThe pain-evoked discharge from the spinal dorsal horn neurons in rats with chronic pain was recorded by the somatic extracellular record method.The 6 experimental rat groups were injected by the normal saline（5 μL），CBT（20，40，80 ng/kg），atropine（2 mg/kg）and atropine（2 mg/kg）+CBT（40 ng/kg）respectively.The influence of different concentrations of CBT on the pain-evoked discharge from the spinal dorsal horn neurons was observed.At the same time，whether cholinergic receptor antagonist atropine overturning its analgesic effect was observed too.ResultsThe different concentrations of CBT could obviously inhibit the pain-evoked discharge from the spinal dorsal horn neuron in rats with chronic pain，the discharge frequency had statistically significant difference betweenthe differentconcentrationandthe normalsaline group（P＜0.05），moreover the effect could be blocked by atropine，the difference of the discharge frequency at 20，30，40，50，60 min had statistical difference between the atropine+CBT group and the CBT40ng/kggroup（P＜0.05）.ConclusionCBT possesses a significantanalgesic effect，this effecthas certain dose dependence and the cholinergic receptor system participates in this analgesic process.

Cobra venoms； Cobra； Neurotoxins； Analgesia

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.19.003

A

1009-5519（2015）19-2896-03

2015-05-28）

關于醫學論文中的志謝

本刊編輯部

江蘇省衛生廳衛生職業技術教育基金資助項目（NJ201112）；揚州環境資源學院校級課題（N201129）。

彭建明（1984-），男，江蘇射陽人，碩士研究生，講師，主要從事醫學神經生物學、痛覺調制的研究；E-mail：shmily_peng@163.com。

于有江（E-mail：51229768@qq.com）。

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