miR-21對食管癌移植瘤模型的作用研究

劉 濤， 張 春， 楊晨晨， 劉 清， 戴 芳， 馬 嵋， 鄭樹濤， 伊力亞爾·夏合丁，壽 璽， 李志強， 林仁勇， 盧曉梅,

(1新疆醫科大學第一附屬醫院臨床醫學研究院， 烏魯木齊 830054; 2新疆醫科大學， 烏魯木齊 830011;3新疆醫科大學第一附屬醫院教學科， 烏魯木齊 830054; 4新疆維吾爾自治區食管癌研究所， 烏魯木齊 830054)

miR-21對食管癌移植瘤模型的作用研究

劉 濤1， 張 春1， 楊晨晨2， 劉 清1， 戴 芳1， 馬 嵋3， 鄭樹濤1， 伊力亞爾·夏合丁4，壽 璽1， 李志強1， 林仁勇1， 盧曉梅1,4

(1新疆醫科大學第一附屬醫院臨床醫學研究院， 烏魯木齊 830054;2新疆醫科大學， 烏魯木齊 830011;3新疆醫科大學第一附屬醫院教學科， 烏魯木齊 830054;4新疆維吾爾自治區食管癌研究所， 烏魯木齊 830054)

目的 探討微小RNA-21(miR-21)對食管癌移植瘤模型腫瘤的作用。方法 建立裸鼠食管癌移植瘤模型，分別用miR-21(miR-21組)、miR-21 抑制劑(miR-21抑制劑組)和生理鹽水進行治療；應用免疫組化技術檢測腫瘤組織中增殖細胞核抗原(Ki-67)、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(Caspase-3)、鋅脂蛋白轉錄因子(Snail)蛋白的表達。 結果 成功建立食管癌裸鼠移植瘤模型，miR-21組和miR-21抑制劑組腫瘤大小差異有統計學意義(P<0.05)，miR-21組Ki-67陽性表達率[(86.28±14.3)%]和Snail陽性表達率[(88.76±12.35)%]明顯高于生理鹽水組[(46.72±15.68)%和(72.35±8.36)%]及miR-21抑制劑組[(19.34±10.23)%和(35.26±10.28)%]；而miR-21組和生理鹽水組的Caspase-3陽性率[(35.27±16.12)%和(45.62±23.32)%]明顯低于miR-21抑制劑組[(76.45±18.32)%]。結論miR-21與食管癌生長和轉移相關，抑制miR-21可抑制移植瘤生長和轉移，并且通過影響Ki-67、Caspase-3和Snail的表達發揮作用。提示miR-21可作為食管癌臨床治療候選靶基因。

裸鼠食管癌移植瘤模型； 微小RNA-21(miR-21)； 增殖細胞核抗原(Ki-67)； 半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(Caspase-3)； 鋅脂蛋白轉錄因子(Snail)

食管癌(Esophageal cancer, EC)是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，在惡性腫瘤中其發病率位居第9位，死亡率位居第6位[1]。食管癌患者5年生存率僅為5%～10%，并且75%的病人在1 a內死亡。

miR-21位于染色體的脆性區域17q23.2，其在肝細胞肝癌、胃癌、卵巢癌、宮頸癌、頭頸部腫瘤細胞株、乳頭狀甲狀腺癌等一系列實體性惡性腫瘤中均出現上調，具有原癌基因的功能[2-7]。本課題組前期研究發現，在體外miR-21對食管癌Eca109細胞增殖具有促進作用，同時轉染miR-21抑制劑后，細胞增殖明顯受到抑制[8]。基于此研究結果，本研究擬研究miR-21對小鼠體內食管癌的生長及其轉移的影響，探討miR-21在食管癌腫瘤發生、發展中的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料食管鱗癌細胞株Eca109購自武漢大學細胞保藏中心，BALB/c雌性裸鼠，周齡4～6 w(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)，miR-21和miR-21 抑制劑由上海吉瑪生物科技有限公司合成，Lipofectamine 2000 購自Invitrogen公司，兔抗人多克隆抗體增殖細胞核抗原(Ki-67)、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(Caspase-3)抗體購自北京博奧森生物科技有限公司，鋅脂蛋白轉錄因子(Snail)抗體購自CST公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立 裸鼠準備: 4～6 w、體質量18～22 g的12只雌性BALB/c裸鼠飼養在恒定溫度(25～27℃)、恒定濕度(40%～50%)的無特定病原體(SPF)層流室中, 所用飼料、飲用水和墊料均經高壓滅菌處理, 并每隔3 d 更換1次，每天12 h明/12 h暗周期。體外培養食管癌細胞株Eca109,取對數生長期細胞用臺盼藍顏色計數活細胞在95%以上時調整細胞密度為1.5×106個/mL，收集并制備單細胞懸液，裸鼠背側皮下注射細胞懸液200 μL(相當于每只裸鼠注射Eca109細胞3×105個)。

1.2.2 動物模型治療 當移植瘤直徑平均約為2 mm時，將裸鼠隨機分為3組:生理鹽水組(對照組)4只，miR-21組4只，miR-21抑制劑組4只。各組瘤內分別給予注射生理鹽水100 μL、50 μg的miR-21 100 μL和3 μL Lipofectamine 2000及miR-21抑制劑100 μL和3 μL Lipofectamine 2000。每周2次，每次治療時測量腫瘤大小[腫瘤體積(mm3)=長×寬2×0.5]，并稱量體質量。4 w后處死小鼠，收集各組腫瘤標本，待檢測。

1.2.3 免疫組化染色 3組瘤塊固定，包埋，切片，HE染色，間接法免疫組化檢測Ki-67、Caspase-3和Snail的表達水平；由2位經驗豐富的病理醫師進行雙盲閱片，采用半定量結果判斷，分別對鏡下每張切片上5個高倍視野(×200)下計數陽性細胞百分比。

1.3 統計學處理應用SPSS 13.0統計軟件進行數據處理，兩組以上標本采用單因素方差分析，以P<0.05為有差異統計學意義。

2 結果

2.1 各組人食管癌移植瘤生長抑制情況12只裸鼠種植人食管癌細胞株Eca109細胞后，移植瘤成功率為100%。miR-21組食管癌移植瘤體積平均為(2 214.41±393.62)mm3，miR-21 抑制劑組腫瘤體積為(908.67±666.24)mm3,生理鹽水組腫瘤體積為(1 120. 28±524.54)mm3，miR-21組移植瘤體積明顯大于miR-21抑制劑組移植瘤體積，差異具有統計學意義(P<0.05)，與生理鹽水組比較差異無統計學意義(P>0.05)(圖1)。

圖1 治療后各組腫瘤大小

2.2 各組治療后移植瘤的組織學觀察HE染色結果顯示，生理鹽水組及miR-21組腫瘤異型性明顯，細胞大小不一且不規則，miR-21抑制劑組可見大片細胞壞死( 圖2)。

a:miR-21 組b: 生理鹽水組c:miR-21抑制劑組

圖2 不同治療組HE染色結果(HE ×200)

2.3 各組瘤細胞增殖指數Ki-67和caspase-3的蛋白表達與生理鹽水組比較，miR-21組Ki-67陽性表達率明顯增加(P<0.05)，miR-21 抑制劑組Ki-67陽性表達率顯著減少，差異均具有統計學意義(P<0.05)(表1、圖3)。與生理鹽水組和miR-21組比較，miR-21 抑制劑組Caspase-3蛋白陽性表達率明顯增加，差異均有統計學意義(P<0.05)，miR-21組與生理鹽水組Caspase-3陽性表達率差異無統計學意義(P>0.05)(表1、圖4)。

2.4 各組鋅指結合蛋白(Snail)的表達差異與生理鹽水組相比，miR-21組Snail陽性表達率明顯增高，差異具有統計學意義(P<0.05)，而miR-21 抑制劑組中Snail陽性表達率明顯減少，與生理鹽水組和miR-21組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)(表1、圖5)。

組別Ki-67Caspase-3SnailmiR-21組86.28±14.3*35.27±16.1288.76±12.35*miR-21抑制劑組19.34±10.23*76.45±18.32*△35.26±10.28*△生理鹽水組46.72±15.6845.62±23.3272.35±8.36

注：與生理鹽水組比較，*P<0.05； 與miR-21組比較，△P<0.05。

a:miR-21 組b: 生理鹽水組c:miR-21抑制劑組

圖3 不同治療組細胞增殖指數Ki-67蛋白表達結果(×200)

a: miR-21 組 b: 生理鹽水組 c: miR-21抑制劑組

圖4 不同治療組Caspase-3蛋白表達結果(×200)

a: miR-21 組 b: 生理鹽水組 c: miR-21抑制劑組

圖5 不同治療組snail蛋白表達結果(×200)

3 討論

腫瘤的發生、發展及轉移是一個多步驟、多因素參與的過程。除原癌基因激活、抑癌基因失活外, 尚有某些凋亡控制基因的異常表達促使細胞惡性轉化,形成惡性腫瘤[9]。微小RNA是指長度為20～22個核苷酸的小分子非編碼RNA分子，對真核細胞的基因表達、細胞發育分化和個體發育等多方面起調控作用。目前研究表明，微小RNA能夠識別特定的目標mRNA，并在轉錄后水平通過負調控或正調控目標基因mRNA的表達，促進目標基因mRNA的降解和/或抑制翻譯過程而發揮作用[10]。迄今為止，人類基因組可能存有1 000多種微小RNA 基因，目前已被證實的微小RNA 有700多種[11]。并且越來越多的證據顯示微小RNA在腫瘤的發生、發展中起著重要的作用，某些特定微小RNA可作為一種癌基因或者抑癌基在腫瘤發生、發展中發揮作用[12]。

本課題組前期在體外細胞水平上發現miR-21可促進食管癌細胞株Eca109的增殖[8]，在此基礎上，本研究選用免疫缺陷型裸鼠為實驗對象，皮下種植人食管癌細胞株Eca109，成瘤率為 100%。分別采用miR-21和miR-21 抑制劑進行治療，4 w后處死小鼠，測量腫瘤大小，結果發現miR-21組瘤塊明顯大于miR-21抑制劑組，提示在體內miR-21可能促進腫瘤的生長。為進一步確認miR-21對瘤塊中細胞增殖或凋亡的影響，本研究采用免疫組化方法檢測瘤塊中細胞增殖指數Ki-67和細胞凋亡基因Caspase-3蛋白的表達，發現miR-21組Ki-67的蛋白表達明顯高于miR-21抑制劑組，而miR-21抑制劑組Caspase-3表達明顯高于生理鹽水組和miR-21組。提示在體內miR-21可能通過促進細胞增殖指數Ki-67的表達和抑制細胞凋亡基因Caspase-3的表達，影響腫瘤細胞的增殖或凋亡，從而導致腫瘤生長明顯緩慢[13]。

Snail屬于轉錄抑制子中的 Snail 超家族(Snail、Slug、Smuc)，其能夠促進細胞遷移，在EMT中發揮著重要的作用[14]。Snail通過直接抑制E-cadherin的表達及上調間質細胞標記分子Vimentin等的表達而促使上皮間質轉化的發生，并促進腫瘤的侵襲和轉移[15-16]。本研究發現，加入miR-21抑制劑后，Snail陽性表達率明顯低于miR-21組和生理鹽水組，miR-21可能通過影響Snail的表達促進食管癌上皮間質轉化，從而促使食管癌發生轉移。提示miR-21可作為食管癌臨床治療的靶基因，為食管癌的治療提供一種新思路。

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(本文編輯 楊晨晨)

The role of miR-21 in xenografted nude mice of human esophageal cancer

LIU Tao1, ZHANG Chun1, YANG Chenchen2, LIU Qing1, DAI Fang3, MA Mei1, ZHENG Shutao1,ILYAR Sheyhidin4, SHOU Xi1, LI Zhiqiang1, LIN Renyong1, LU Xiaomei1,4

(1ClinicalMedicalResearchInstitute,theFirstAffliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi, 830054,China;2XinjiangMedicalUniversity，Urumqi830011,China;3EducationAdministrationOffice,theFirstAffliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi, 830054,China;4EsophagealCancerResearchInstituteofXinjiangUygurAutonomousRegion,Urumqi830054,China)

Objective To explore the role of microRNA-21 (miR-21) in carcinogenesis and metastasis in xenografted nude mice of human ESCC cell line Eca109. Methods Based on ESCC xenografted nude mice model, miR-21 mimics and AMO (Anti-miR-21 Oligonucleotides) were subcutaneously inoculated into xenografted tumor, respectively. The cell growth and morphological alteration were observed. Meanwhile, the expression level of Ki-67, cleaved Caspase-3 and Snail was detected using immunohistochemistry. Results ESCC xenografted nude mice model was successfully established. There is significant difference between the group inoculated with miR-21 mimics and group with AMO (P<0.05).ThepositiverateofKi-67(86.28%±14.3%)andSnail(88.76%±12.35%)wassignificantlyhigheringroupwithmiR-21mimicsthanthatingroupwithAMO(19.34%±10.23%；35.26%±10.28%)andsteriledsalinegroup(46.72%±15.68%；72.35%±8.36%),respectively.WhereasthepositivestainingofactiveCaspase-3ingroupwithmiR-21 (35.27%±16.12%)andsteriledsaline(45.62%±23.32%)weresignificantlylowerthanthatingroupinoculatedwithAMO(76.45%±18.32%) . Conclusion The present results suggested that miR-21 was associated with tumor growth and metastasis, and that miR-21 AMO can inhibit the growth of tumor by targeted the expression of Ki-67, Caspase-3 and Snail, which indicating that miR-21 could be used as potential therapeutic target in ESCC.

xenografted nude mice of esophageal cancer； miR-21; Ki-67； Caspase-3; Snail

國家自然科學基金(81160303，81260359、U1303321);新疆維吾爾自治區重大科技專項計劃(201430123-1)； 新疆重大疾病重點實驗室開放課題(SKLIB-XJMDR-2014-15)

劉 濤(1984-),男，碩士，助理研究員，研究方向：消化道腫瘤。

盧曉梅，女，博士，教授，研究員，博士生導師，研究方向：消化道腫瘤的轉化醫學研究，E-mail：luxiaomei88@163.com。

專題研究 作者簡介：盧曉梅, 教授，研究員，博士生導師。現任新疆維吾爾自治區免疫學會理事長、中國醫藥生物技術學會組織生物樣本庫分會常務委員、中華醫學會醫學科學研究管理學分會青年委員會委員、中華醫學會醫學倫理學分會青年委員會委員、中國遺傳學會國際交流委員會委員、新疆醫科大學第一附屬醫院倫理委員會副主任委員、科技部省部共建國家重點實驗室培育基地-新疆維吾爾自治區重大疾病醫學重點實驗室學術委員會委員、中華醫學科技獎評委會委員和國家自然科學基金項目評議人。擔任 《世界華人消化雜志》、《疾病預防控制通報》編委；《Molecular Biology Reports》、《Cellular & Molecular Biology Letters》、《Cancers》、《Asia-Pacific Journal of Clinical Oncology》等期刊審稿人。

在中國科學院研究生院博士后流動站出站后，以客座教授、訪問學者身份，先后赴美國、英國、法國、奧地利等國開展腫瘤合作研究。先后主持科研課題共15項，其中包括國家自然科學基金5項、中國博士后科學基金1項、新疆維吾爾自治區科技援疆計劃1項、新疆維吾爾自治區高技術研究發展計劃1項等。目前主持項目：國家自然科學基金3項“哈薩克族食管鱗癌惡性表型的微環境調控研究(U1303321)”，“哈薩克族食管鱗癌上皮間質轉化調控及其分子病理學意義(81260359)”，“基于M2型丙酮酸激酶、膜聯蛋白A2靶點的哈族食管鱗癌分子分型研究(81160303)”。新疆維吾爾自治區重大科技專項計劃“上皮間質轉化在炎癥誘導食管癌胃癌發生發展中TGF-β關鍵信號通路和調控分子的研究 (201430123-1)”。

食管癌惡性表型與上皮間質轉化(EMT)的關聯性

R332;R

A

1009-5551(2015)12-1461-05

10.3969/j.issn.1009-5551.2015.12.001

2015-08-30]

作為主要貢獻者，榮獲新疆維吾爾自治區科學技術進步獎二等獎、新疆醫學科技獎一等獎、新疆維吾爾自治區自然科學優秀論文二等獎等共12項。作為第一或通信作者，發表論文56篇，其中SCI收錄25篇。被新疆維吾爾自治區人民政府授予第五屆“新疆青年科技獎”以及“新疆醫學會科技之星”稱號。

2003年獲得碩士生導師資格，培養碩士研究生16名，其中14名已經順利畢業。2011年獲得博士生導師資格，指導博士生4名。

癌細胞的浸潤、轉移是癌癥患者的主要死亡原因。癌細胞的浸潤、轉移是復雜的過程，但并非所有的癌細胞都具有浸潤、轉移的能力，在具有高度選擇性的過程中，除依賴于癌細胞的內在分子機制外，癌微環境的調控發揮重要作用。癌細胞與微環境相互作用，其形態結構和分化狀態經歷可調控的動態變化：上皮樣癌細胞可轉化為具有浸潤、轉移狀態的間質樣細胞，在合適的微環境中，間質樣細胞也可反向分化為上皮樣腫瘤細胞，形成轉移灶，即腫瘤微環境的變化與上皮間質轉化(EMT)在腫瘤的癌變、進展中密切相關。本專題探討食管癌惡性表型與EMT的關聯性，可為食管癌的惡性表型機制提供科學依據。