MiR-106b對食管癌KYSE150細胞的生長及細胞上皮間質轉化的影響

戴 芳， 劉 濤， 鄭樹濤， 劉 清， 王 棟， 伊力亞爾·夏合丁， 盧曉梅

(1新疆醫科大學第一附屬醫院臨床醫學研究院， 2新疆維吾爾自治區食管癌研究所， 烏魯木齊 830054)

MiR-106b對食管癌KYSE150細胞的生長及細胞上皮間質轉化的影響

戴 芳1， 劉 濤1， 鄭樹濤1， 劉 清1， 王 棟1， 伊力亞爾·夏合丁2， 盧曉梅2

(1新疆醫科大學第一附屬醫院臨床醫學研究院，2新疆維吾爾自治區食管癌研究所， 烏魯木齊 830054)

目的 研究微小RNA106b(miR-106b)對食管癌KYSE150細胞增殖、遷移、侵襲及上皮間質轉化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)的影響，為臨床治療食管癌提供新的理論依據。方法 用miR-106b慢病毒轉染KYSE150細胞，實驗分為3組：control組 (未轉染miR-106b的KYSE150細胞)、miR-NC組(轉染隨機序列)和miR-106b組 (轉染miR-106b的KYSE150的細胞)。采用實時熒光定量聚合酶聯反應(qRT-PCR)和免疫印跡(Western Blot)檢測miR-106b和EMT的相關標記物E-鈣黏蛋白(E-Cadherin)、神經型鈣黏蛋白(N-Cadherin)的表達情況， 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法(MTT法)檢測細胞的增殖能力，劃痕實驗檢測細胞的遷移能力，Transwell方法檢測細胞的侵襲能力。結果 慢病毒穩定轉染miR-106b后，食管癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力均增強(P<0.05)；qRT-PCR與Westernblot檢測顯示miR-106b組E-Cadherin表達較miR-NC組、control組明顯降低(P<0.05)；N-Cadherin表達明顯升高(P<0.05)。結論miR-106b能夠促進食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲，同時能促進上皮間質的轉化。

miR-106b； 細胞增殖； 細胞遷移； 細胞侵襲； 上皮間質轉化

食管癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一。目前手術是治療食管癌最有效的方法，但晚期食管鱗癌5年生存率仍低于15%[1]，淋巴結轉移依然是預后不良的因素[2]。因此，分子病理學研究對食管癌的發生、發展及轉移起著關鍵性的作用。MicroRNA(miRNA)是一類非編碼小RNA分子，其長度約22個核苷酸，參與轉錄后水平mRNA的降解或翻譯抑制來調控基因表達,在腫瘤的形成中具有重要作用[3]。微小RNA106b(miR-106b)基因是miR-106b-25家族中的一員。多數研究表明，miR-106b-25基因簇的3個成員在腫瘤中同時存在是相當少的，大部分只是其中1個或2個成員高表達。而miR-106b經常作為致癌因素的miRNA分子，在喉癌[4]、胃癌[5]、乳腺癌[6]、肝癌[7]等多種腫瘤組織中高表達，具有調控腫瘤細胞遷移、侵襲、增殖等重要的功能。近年來研究發現，高表達的miR-106b促進了腫瘤細胞上皮間質轉化(EMT)的發生，即腫瘤細胞由上皮表型向間質表型發展，參與了腫瘤的侵襲和轉移[8]。本課題組通過微陣列法發現Has-miR-106b在食管癌組織中明顯表達上調，本研究在此基礎上，在細胞水平及分子水平上進一步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料食管鱗癌細胞株KYSE150由中國醫學科學院國家重點實驗室贈送，RPMI-1640培養基、胎牛血清、胰蛋白酶(美國Gibco公司)，二甲基亞楓DMSO(美國Invitrogen公司)，慢病毒LV-hsa-mir-106b(14968-1)和陰性對照病毒CON238(上海吉凱公司)，RNA反轉錄試劑盒(美國Thermo公司)，熒光定量PCR試劑盒(日本Takara公司)，RIPA裂解液、BCA試劑盒(美國Thermo公司)，EMT抗體試劑盒(美國Cell Signaling公司)，內參抗體(美國Abcam公司)，Western blot二抗試劑盒(美國Invitrogen公司)，PVDF膜(美國Thermo公司)，四甲基偶氮唑鹽MTT(美國Invitrogen公司)，Transwell 小室(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養、轉染和分選 食管鱗癌細胞株KYSE150用含有10%胎牛血清的1640培養液，在37℃、5%CO2細胞培養箱中培養。實驗分為3組：control組 (未轉染miR-106b的KYSE150細胞)、miR-NC組(轉染隨機序列)和miR-106b組 (轉染miR-106b的KYSE150的細胞)，用慢病毒試劑進行轉染.。將細胞按約3×105個/孔的密度接種于6孔板中，第2天待細胞生長達70%～80%時，按說明書進行慢病毒轉染，8～12 h后棄去含有病毒的舊培養液，換含10%胎牛血清的1640培養液，在37℃、5%CO2細胞培養箱中繼續培養48 h。 每組設3個復孔。 轉染48 h后，正常程序消化細胞并收集至15 mL離心管中，各組做好標記，1 000 r/min離心5 min,后用無血清的1640培養液每管500 μL重懸，置于冰上，用流式細胞儀篩選帶有GFP標記的轉染細胞。

1.2.2 實時熒光定量RT-PCR檢測各組細胞的 mRNA 的相對表達量 收獲各組細胞，按照 Trizol 試劑盒說明書提取總 RNA。按照PCR反轉錄試劑盒說明書，將總RNA反轉錄成cDNA。PCR反應體系包括TAKARA通用熒光染料SYBR Premix Ex TaqTM10 μL、miRNA上游及下游引物各1 μL 10 μM 、 cDNA產物2 μL、無核酸酶水6 μL，共20 μL。將PCR總反應體系混勻，離心。每孔為20 μL PCR反應體系，每組設3個復孔，離心。采用三步法，反應條件：起始激活95℃反應3 min；PCR循環50次，95℃反應10 s，58℃反應30 s； PCR再進行81個循環，58℃反應10 s。結果采用2-ΔΔCt法進行分析。引物由上海生工公司設計合成(表1)。

表1 反轉錄及qRT-PCR所用引物序列表

1.2.3 Western blot實驗 收獲各組細胞，用RIPA裂解液裂解并提取細胞總蛋白，BCA試劑盒定量檢測蛋白濃度，將蛋白樣品和4×蛋白上樣緩沖液按3∶1的比例混勻、離心，置于PCR儀中使蛋白變性，100℃ 10 min。以每孔上樣量為50 μg，制備10%SDS-PAGE凝膠進行電泳分離。分離的蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，室溫封閉1 h，分別加入1∶1 000稀釋的兔抗人的E-Cadherin抗體、N-Cadherin抗體和GAPDH抗體，于4℃孵育過夜，之后用PBS-Tween20洗膜3次，每次5 min，蒸餾水洗膜1次，每次5 min；加入人抗兔二抗室溫孵育1.5 h，用PBS-Tween20洗膜3次，每次5 min，蒸餾水洗膜1次，每次5 min；加入顯影液顯色，顯出紫色條帶后，用蒸餾水終止顯色，在成像分析系統上成像并進行密度分析。以GAPDH為內參，計算各組蛋白的相對表達量。

1.2.4 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法(MTT法) 正常消化呈對數生長期細胞，96孔板按3×103個/孔接種細胞，每組設4個復孔，每孔體積為200 μL。分別于轉染前及轉染后24、48、72、96、120 h時，將事先配好的MTT溶液按20 μL/孔加入，37℃、 5% CO2恒溫培養箱孵育4 h后棄去上清液，每孔再加入二甲基亞砜(DMSO)15 μL，搖床上搖10 min，使之充分溶解，見紫色結晶物出現，用酶標儀檢測各組細胞，在波長為490 nm處測定各孔吸光度值，記錄結果并繪制生長曲線。

1.2.5 細胞劃痕實驗 正常消化呈對數生長期細胞，6孔板按5×105個/孔接種細胞，當細胞生長面積達80%時，用10 μL無菌槍頭劃痕，每孔均勻劃3條線，再用PBS潤洗2遍，棄之，分別于轉染前及轉染后24、48 h時在倒置顯微鏡下觀察劃痕愈合速度并拍照。

1.2.6 細胞侵襲實驗 正常消化呈對數生長期細胞，Transwell小室按3×105個/孔接種細胞，用無血清的1640培養液200 μL重懸，下室為10% FBS 1640培養液500 μL，每組設3個復孔。分別于48 h后，將Transwell小室用無菌PBS洗2遍，甲醇固定30 min，PBS再次洗2遍，結晶紫染色30 min后用PBS洗2遍，干燥，在倒置顯微鏡下選取5個視野拍照并計數。

2 結果

2.1 qRT-PCR檢測慢病毒轉染KYSE 150細胞后miR-106b的mRNA的表達變化control組和miR-NC組較miR-106b組的mRNA表達水平明顯增高(P<0.05)(圖1)。

2.2 miR-106b基因過表達后對KYSE150細胞增殖影響慢病毒轉染miR-106b基因后， 0 h和24 h時各組490 nm波長處吸光度值差異無統計學意義(P>0.05)，48、72、96、120h時miR-106b組吸光度值明顯高于control組和miR-NC組(P<0.05)(圖2)。

與control組比較，*P<0.05； 與miR-NC組比較，△P<0.05。

圖1 qRT-PCR檢測慢病毒轉染KYSE 150細胞后miR-106b mRNA相對表達量

與control組比較，*P<0.05； 與miR-NC組比較，△P<0.05。

圖2 MTT檢測miR-106b轉染KYSE150后細胞增殖能力變化

2.3 miR-106b基因過表達后對KYSE150細胞遷移能力的影響慢病毒轉染miR-106b基因后， 與control組和miR-NC組比較，miR-106b組的遷移能力明顯更強并基本愈合，差異均有統計學意義(P<0.05)，而control組與miR-NC組遷移能力比較差異無統計學意義(P>0.05)(圖3)。

2.4 miR-106b基因過表達后對KYSE150細胞侵襲能力的影響慢病毒轉染miR-106b基因后，與control組和miR-NC組比較，miR-106b組的侵襲能力明顯更強(P<0.05)(圖4)。

2.5 miR-106b基因過表達后對EMT的影響

2.5.1 miR-106b基因過表達后E-Cadherin和N-Cadherin的 mRNA的表達變化 與control組和miR-NC 組比較， miR-106b組E-Cadherin的mRNA表達水平下降(P<0.05)， N-Cadherin的 mRNA 表達水平升高(P<0.05) (圖5)。

2.5.2miR-106b基因過表達后E-Cadherin和N-Cadherin的蛋白的表達變化Westernblot檢測結果顯示,E-Cadherin蛋白條帶在135kDa處顯色，N-Cadherin蛋白條帶在140kDa處顯色，GAPDH蛋白條帶在37kDa處顯色。miR-106b組E-Cadherin蛋白的相對表達量明顯低于control組及miR-NC組細胞蛋白的相對表達量,差異有統計學意義(P<0.05)；miR-106b組N-Cadherin蛋白的相對表達量顯著高于control組和miR-NC組細胞蛋白的相對表達量,差異具有統計學意義(P<0.05)(圖6)。

a: 劃痕細胞圖

b: 柱狀圖

與control組比較，*P<0.05； 與miR-NC組比較，△P<0.05。

圖3 細胞劃痕實驗檢測miR-106b轉染KYSE150后細胞遷移能力變化(放大倍數×100)

a: 侵襲細胞圖

b: 柱狀圖

與control組比較，*P<0.05； 與miR-NC組比較，△P<0.05。

圖4 細胞侵襲實驗檢測miR-106b轉染KYSE150后細胞侵襲能力變化(放大倍數×100)

a: E-Cadherin的mRNA的相對表達量 b: N-Cadherin的mRNA相對表達量

與control組比較，*P<0.05； 與miR-NC組比較，△P<0.05。

圖5 qRT-PCR檢測慢病毒轉染KYSE 150細胞后E-Cadherin和N-Cadherin mRNA相對表達量

圖6 Western blot 檢測慢病毒轉染KYSE 150細胞后E-Cadherin和N-Cadherin mRNA相對蛋白表達

3 討論

MiR-106b定位于人類染色體7q22，屬于miR-106b-25基因簇的一員，通過大量的研究表明,miR-106b在腫瘤中被視為癌基因,是與腫瘤生長、細胞生存和血管形成相關的miRNA[9]。

已經有大量研究證實，miR-106b參與了多種重要的信號通路。在轉化生長(TGF-β)因子信號通路中，可以通過調控p21[10]或EMT相關信號通路[8]促使腫瘤細胞逃避TGF-β誘導的生長抑制作用，參與了腫瘤細胞的遷移、侵襲、凋亡、周期和增殖等生物進程[11]。miR-106b基因也是insulin/IGF通路的一部分，通過下調PTEN的表達，影響細胞周期和腫瘤細胞微環境[12]。也可通過調控RB基因來參與細胞周期進程[13]。多項研究報道，miR-106b在肝癌細胞中促進了細胞的遷移和侵襲[10]。在胃癌細胞中，miR-106b通過調控靶基因PTEN來促進細胞的遷移和浸潤[5]。

目前，miR-106b在食管癌方面的表達及功能研究報道比較少。研究發現miRNAs的異常表達可以明顯影響食管癌的進程[14]。Kan等[15]用基因芯片和qRT-PCR方法分析食管細胞(HEEpiC、QhTRT、ChTRT、GihTRT和OE-33)和食管組織(正常上皮組織、Barrett食管組織和食管腺癌組織)，結果發現在腫瘤發生的不同階段，隨著miR-106b基因的擴增，miR-106b的表達量也升高，在細胞功能實驗和動物實驗中顯示miR-106b具有促增殖、抗凋亡和細胞周期促進作用。本研究顯示,與對照組相比，高表達miR-106b的KYSE150細胞促進了細胞的增殖、遷移和侵襲。進一步檢測發現，過表達miR-106b的KYSE150細胞、上皮表型E-Cadherin的表達明顯降低，間質表型N-Cadherin明顯升高，促進了EMT的發生。而高表達的miR-106b可能通過TGF-β信號通路實現其功能。通常腫瘤細胞會逃避抑瘤作用，將TGF-β信號轉換成促進信號，通過該信號誘導維持上皮間質轉化(EMT)、促進腫瘤細胞的侵襲和轉移等[16]。Smith等[17]對乳腺癌的研究發現，miR-106b可以靶向Smad7來激活TGF-β信號通路和促進EMT的發生。最近，Zhou等[6]研究表明，miR-106b可以通過E-Cadherin介導激活蛋白EP300來調控EMT的發生，使乳腺癌細胞產生對阿霉素的耐藥性。Yau等[10]對肝癌細胞的研究證實，過表達miR-106b可以激活EMT，增加肝癌細胞的運動和侵襲能力。然而，也有研究顯示高表達 miR-106b對子宮內膜癌起抑制轉移的作用[18]。可見，miR-106b在不同類型的腫瘤中擁有反應癌基因或抑制癌基因的功能。

綜上所述，miR-106b具有促進癌細胞生長的作用，且miR-106b可能通過EMT來促進食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲，但這還需要進一步研究證實。本研究結果可為食管癌的預防診斷及治療提供新的理論依據。

[1] Napier KJ, Scheerer M, Misra S. Esophageal cancer:a review of epidemiology, pathogenesis,staging workup and treatment modalities[J]. Gastrointest Oncol, 2014, 6(5):112-120.

[2] Vidovic V, Nikolic I, Vukojevic J, et al. Unusual metastasis of esophageal cancer [J].Vojnosanit Pregl, 2014, 71(10):975-977.

[3] Blandino G, Fazi F, Donzelli S, et al. Tumor suppressor microRNAs:a novel non-coding alliance against cancer[J]. FEBS Lett,2014, 588(16):2639-2652.

[4] Xu Y, Wang K, Gao W, et al. MicroRNA-106b regulates the tumor suppressor RUNX3 in laryngeal carcinoma cells[J]. FEBS Lett, 2013, 587(19):3166-3174.

[5] Yang TS, Yang XH, Chen X, et al. MicroRNA-106b in cancer-associated fibroblasts from gastric cancer promotes cell migration and invasion by targeting PTEN[J] .FEBS Lett,2014,588(13):2162-2169.

[6] Zhou Y, Hu Y, Yang M, et al. The miR-106b～25 cluster promotes bypass of doxorubicin-induced senescence and increase in motility and invasion by targeting the E-cadherin transcriptional activator EP300[J]. Cell Death Differ, 2014, 21(3):462-474.

[7] Li Y, Tan W, Neo TW, et al. Role of the miR-106b-25 microRNA cluster in hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Sci,2009,100(7):1234-1242.

[8] Yau WL, Lam CS, Ng L, et al. Over-expression of miR-106b promotes cell migration and metastasis in hepatocellular carcinoma by activating epithelial-mesenchymal transition process [J]. PLoS One, 2013, 8(3):e57882.

[9] Li F, Liu J, Li S. MicorRNA 106b approximately 25 cluster and gastric cancer[J]. Surg Oncol, 2013, 22(2):e7-10.

[10] Zhao ZN, Bai JX, Zhou Q, et al. TSA suppresses miR-106b-93-25 cluster expression through downregulation of MYC and inhibits proliferation and induces apoptosis in human EMC[J]. PLoS One, 2012,7(9):e45133.

[11] Ikushima H, Miyazono K. TGFbeta signalling:a complex web in cancer progression[J]. Nat Rev Cancer,2010,10(6):415-424.

[12] Poliseno L, Salmena L, Riccardi L, et al. Identification of the miR-106b～25 microRNA cluster as a proto-oncogenic PTEN-targeting intron that cooperates with its host gene MCM7 in transformation[J].Sci Signal,2010, 3(117):ra29.

[13] Cai K, Wang Y, Bao X. MiR-106b promotes cell proliferation via targeting RB in laryngeal carcinoma[J]. J Exp Clin Cancer Res,2011, 30:73.

[14] Gu J, Wang Y, Wu X. MicroRNA in the pathogenesis and prognosis of esophageal cancer[J]. Curr Pharm Des, 2013,19(7):1292-1300.

[15] Kan T, Sato F, Ito T, et al. The miR-106b-25 polycistron, activated by genomic amplification, functions as an oncogene by suppressing p21 and Bim[J]. Gastroenterology,2009,136(5):1689-1700.

[16] Massague J. TGF beta in Cancer[J]. Cell, 2008, 134(2):215-230.

[17] Smith AL, Iwanaga R, Drasin DJ, et al. The miR-106b-25 cluster targets Smad7, activates TGF-beta signaling, and induces EMT and tumor initiating cell characteristics downstream of Six1 in human breast cancer[J].Oncogene, 2012, 31(50):5162-5171.

[18] Dong P, Kaneuchi M, Watari H, et al. MicroRNA-106b modulates epithelial-mesenchymal transition by targeting TWIST1 in invasive endometrial cancer cell lines[J]. Mol Carcinog,2014, 53(5):349-359.

(本文編輯 楊晨晨)

MicroRNA-106b promotes proliferation of esophageal cancer cell and Epithelial-Mesenchymal Transition process

DAI Fang1, LIU Tao1, ZHENG Shutao1, LIU Qing1, WANG Dong1, Ilyar Sheyhidin2, LU Xiaomei2

(1ClinicalMedicalResearchInstitute,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,2EsophagealCancerResearchInstituteofXinjiangUygurAutonomousRegin,Urumqi830054,China)

Objective To investigate the effects of miR-106b in the esophageal cancer cell proliferation, migration, invasion. Methods Based on KYSE150 cell transfected with miR-106b, the expression of miR-106b and EMT-associated markers were detected by quantitative RT-PCR(qRT-PCR). EMT-associated proteins were measured by western blot and cell proliferation was detected by using MTT assay. In addition, cell migration and invasion ability were evaluated by wound healing assay and transwell assay. Results The results showed that the cell proliferation, migration and invasion was significantly increased in esophageal cancer KYSE150 (P<0.05)aftertransfectedwithmiR-106b.Furthermore,expressionofE-CadherinwassignificantlylowerinthegroupoftransfectedwithmiR-106bthanthecontrolgroup(P<0.05).Meanwhile,expressionofN-Cadherinwashigher(P<0.05). Conclusion The present data revealed that miR-106b could promote the cell proliferation and has potential in effect on EMT process in esophageal cancer.Keywords: miR-106b; cell proliferation; cell migration; cell invation; epithelial-mesenchymal transition (EMT)

國家自然科學基金(81160303，81260359、U1303321);新疆維吾爾自治區重大科技專項計劃(201430123-1)

戴 芳(1987-)，女，在讀碩士，研究方向：腫瘤分子病理學。

盧曉梅，女，博士，教授，研究員，博士生導師，研究方向：消化道腫瘤的轉化醫學研究，E-mail：luxiaomei88@163.com。

R34;R

A

1009-5551(2015)12-1466-05

10.3969/j.issn.1009-5551.2015.12.002

2015-08-30]