PB和TPM對未成熟腦大鼠遠期學習記憶的影響及刺五加的保護作用

葛利吉，楊 琳，韓 玲，劉 宇，齊薛浩

(1.陜西中醫學院，陜西 咸陽712000；2.西安交通大學醫學院第二附屬醫院，陜西 西安710000；3.西安市兒童醫院，陜西 西安710000)

PB和TPM對未成熟腦大鼠遠期學習記憶的影響及刺五加的保護作用

葛利吉1，楊 琳2，韓 玲1，劉 宇2，齊薛浩3

(1.陜西中醫學院，陜西 咸陽712000；2.西安交通大學醫學院第二附屬醫院，陜西 西安710000；3.西安市兒童醫院，陜西 西安710000)

目的 通過短期給予新生幼鼠不同抗癲癇藥，觀察苯巴比妥(PB)和托吡酯(TPM)對幼鼠遠期學習記憶功能的影響及刺五加的保護作用。方法 實驗動物分兩批：第1批3窩健康3日齡Sprague-Dawley(SD)大鼠30只(雌、雄不分)隨機分為3組，生理鹽水對照組10只、苯巴比妥組10只、苯巴比妥+刺五加組10只；第2批3窩健康3日齡Sprague-Dawley(SD)大鼠30只(雌、雄不分)隨機分為3組，生理鹽水對照組10只，托吡酯組10只，托吡酯+刺五加組10只。對照組給予生理鹽水10mL·kg-1·d-1，苯巴比妥組：苯巴比妥62.5mg·kg-1·d-1，苯巴比妥+刺五加組：苯巴比妥62.5mg·kg-1·d-1，刺五加干粉5.6g·kg-1·d-1。托吡酯組：40mg·kg-1·d-1，托吡酯+刺五加組：托吡酯40mg·kg-1·d-1，刺五加干粉5.6g·kg-1·d-1。每日稱重后腹腔注射，連續3天。正常飼養至1月齡，最后各組選取8只大鼠，參加水迷宮測試。結果 苯巴比妥干預組大鼠尋找水下平臺的潛伏期較對照組明顯延長，均存在顯著性差異(t=-3.542，P=0.005)；穿越有效區次數較對照組減少(t=3.352，P=0.005)。加用刺五加保護后，與對照組比較，潛伏期(t=-1.313，P=0.210)及穿越有效區次數(t=0.051，P=0.128)均無顯著性差異。托吡酯干預組大鼠與對照組比較潛伏期(t=-1.920，P=0.075)、穿越有效區次數(t=1.915，P=0.076)；托吡酯組與托吡酯+刺五加組比較潛伏期(t=-0.597，P=0.560)、穿越有效區次數(t=1.660，P=0.119)，均無顯著性差異。結論 未成熟腦短期應用苯巴比妥損害遠期學習記憶，刺五加具有保護作用，短期應用中等劑量的托吡酯不會對未成熟腦產生遠期學習記憶障礙。

苯巴比妥；托吡酯；刺五加；未成熟腦；學習記憶

驚厥是臨床常見的急癥，是小兒時期常見的急重病證，臨床以抽搐伴神志不清為主要癥狀。流行病學研究顯示，全球約有1%～2%的人一生中至少有1次驚厥發作，生后1歲以內，尤其新生兒時期是發病的高峰，這一時期神經細胞對內外界環境的變化極為敏感[1]。因此，驚厥的預防和治療是必要的，而目前抗癲癇藥仍是控制小兒驚厥的首選藥物[2]。本實驗應用短期苯巴比妥(PB)及托吡酯(TPM)的兩種抗癲癇藥幼鼠模型，及抗癲癇藥加用刺五加保護模型，通過Morris水迷宮實驗，測試幼鼠學習和記憶能力的變化，從行為學上來推斷短期內分別應用兩種抗癲癇藥是否會對未成熟腦產生認知損害，以及加用刺五加后對認知是否有改善作用。

1 材料與方法

1.1 材料

生后3天清潔級健康未成熟(Sprague-Dawley，SD)窩鼠，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供。苯巴比妥粉針劑(批號140613)、托吡酯(批號H20020555)、刺五加噴霧干燥粉(批號：20080401)、生理鹽水(批號G114071604)。Morris水迷宮實驗裝置由西安交通大學醫學院機能中心提供。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組情況

實驗分兩批進行：第1批苯巴比妥干預，生后3d未成熟SD窩鼠3窩，隨機分為苯巴比妥組、苯巴比妥+刺五加組、生理鹽水對照組各10只；第2批托吡酯干預，生后3d未成熟SD窩鼠3窩，托吡酯組、托吡酯+刺五加組、生理鹽水對照組各10只。

按照分組給藥，對照組：生理鹽水10mL·kg-1·d-1。依據Meeh-Rubner的人與大鼠間藥物劑量體表面積換算公式及相關文獻[3]，最終確定用藥劑量分別是：苯巴比妥62.5mg·kg-1·d-1(相當于臨床搶救劑量10mg·kg-1·d-1，托吡酯40mg·kg-1·d-1(相當于臨床搶救劑量7mg·kg-1·d-1)，刺五加干粉5.6g·kg-1·d-1。分別一次性腹腔注射。每日稱重后，根據體重調整藥物劑量。每日同一時間給藥，連續給藥3d，正常飼養，第21d斷奶分籠，第30d每組各選取8只參加Morris水迷宮測試。

1.2.2 實驗裝置情況

Morris水迷宮MT200USB跟蹤系統，它包括一個圓形乳白色水池，直徑120cm，高50cm；池壁上標有東南西北4個入水點，將水池等分為4個象限；目標象限的固定位置放一直徑9cm、高27cm的圓形乳白色平臺，水面高于平臺1.5cm，整個實驗期間平臺位置保持不變；水中加1kg奶粉，溫水沖開，以隱藏平臺，水溫保持在22±0.5℃，用苦味酸在實驗動物的頭部和背部涂成較大相連的區域，便于攝像；實驗期間迷宮外有足夠的參照物，且始終保持不變。迷宮上方安置帶有顯示系統的攝像機，同步記錄動物游泳軌跡，Morris水迷宮數據采集和分析軟件記錄相關數據及圖象結果。

1.2.3 水迷宮行為測試

參照羅小泉等[4]水迷宮試驗方法，測試包括定位航行試驗和空間探索試驗兩個部分，①定位航行試驗：用于對空間位置的學習能力，第30d正式實驗，每只大鼠每天測驗8次，上午4次，下午4次，連續4d。測試大鼠面向池壁沒入水中，其入水點在東西南北隨機選取。記錄大鼠游上平臺所需時間(即潛伏期)，每次大鼠游上平臺，待其在平臺上停留30s后取出動物，再進行下一只實驗。若潛伏期超過120s則人工將動物引導至平臺并停留30s，且該次測驗的潛伏期記錄為120s。取8次逃避潛伏期平均值為每天的逃避潛伏期；②空間探索：用于對平臺空間位置的記憶能力。于第35d上午撤除平臺，將大鼠頭向平臺對側象限宮壁的中點放入水中，記錄大鼠120s內穿過原平臺象限及位置的次數，和在原平臺象限探索時間與總時間(120s)的百分比，原平臺象限與120s內游泳總路程之比，以此評價動物對已獲取信息的存儲、記憶能力。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 苯巴比妥干預各組情況

各組大鼠尋找平臺的潛伏期隨著實驗進行逐日遞減，見圖1。苯巴比妥組大鼠較對照組大鼠尋找水下平臺的潛伏期明顯延長(t=-3.542，P=0.005)，穿越有效區次數較對照組減少(t=3.352，P=0.005)，差異均存在統計學意義；苯巴比妥組120s內平臺象限路程與總路程之比小于對照組(t=1.275，P=0.223)，但差異無統計學意義。

苯巴比妥組與苯巴比妥+刺五加組比較，苯巴比妥干預潛伏期明顯延長(t=2.378，P=0.016)，穿越有效區次數減少(t=-2.640，P=0.018)，差異均存在統計學意義；苯巴比妥組120s內平臺象限路程與總路程之比小于苯巴比妥+刺五加組(t=-0.604，P=0.556)，但差異無統計學意義。

苯巴比妥+刺五加組與對照組比較，潛伏期(t=-1.313，P=0.210)、穿越有效區次數(t=0.051，P=0.128)、120s內平臺象限路程與總路程之比(t=0.785，P=0.446)，各項指標差異均無統計學意義，見表2。

Table 1 Comparison of experiment results of Morris water maze in PB intervention groups

圖1 苯巴比妥干預各組大鼠每天逃避潛伏期均值線形圖

Fig.1 Line diagram of average escape incubation period every day of PB intervention groups

2.2 托吡酯干預各組情況

各組大鼠尋找平臺的潛伏期隨著實驗進行逐日遞減，見圖2。托吡酯組大鼠尋找水下平臺的潛伏期大于對照組(t=-1.920，P=0.075)，穿越有效區次數較對照組減少(t=1.915，P=0.076)，120s內平臺象限路程與總路程之比小于對照組(t=0.838，P=0.416)，但差異均無統計學意義。

托吡酯組與托吡酯+刺五加組比較，潛伏期(t=1.521，P=0.150)、穿越有效區次數(t=-0.675，P=0.511)、120s內平臺象限路程與總路程之比(t=-0.388，P=0.704)差異均無統計學意義。

托吡酯+刺五加組與對照組比較，潛伏期(t=-0.597，P=0.560)、穿越有效區次數(t=1.660，P=0.119)，120s內平臺象限路程與總路程之比(t=0.721，P=0.482)差異均無統計學意義，見表2。

Table 2 Comparison of experiment results of Morris water maze in TPM intervention groups

圖2 托吡酯干預各組大鼠每天逃避潛伏期均值線形圖

Fig. 2 Line diagram of average escape incubation period every day of TPM intervention groups

3 討論

新生兒期是大腦的快速發育期,在此期間大腦內大量神經細胞進行增殖、分化、遷移、突觸生成以及細胞間網絡建成等生長發育,這時期腦神經細胞最易受內外界各種不良因素的影響[5]。認知功能是指人們熟練運用知識的能力，包括學習新知識的能力和從豐富的知識庫中追憶知識的能力，如計算能力、抽象概括能力、判斷事物之間的相似性與差別(分析和運用知識)的能力等，它是判斷腦功能的一個主要指標[6]。海馬是學習記憶的關鍵部位，Morris水迷宮是研究與海馬功能直接相關的空間學習記憶的方法，可客觀反映動物的空間學習記憶能力[4]。

3.1 苯巴比妥對未成熟腦學習記憶的影響及刺五加的保護作用

苯巴比妥作為傳統的抗癲癇藥一直廣泛應用于臨床。行為學研究發現圍產期暴露于苯巴比妥的大鼠在八臂迷宮試驗、水迷宮試驗等空間學習實驗中顯示能力下降[7]。研究表明即使是單次給予大劑量苯巴比妥也會改變小腦PCs的突觸功能，可能對幼鼠的學習和認知功能產生不良影響[8]。本實驗結果顯示，在Morris水迷宮實驗中，苯巴比妥干預組大鼠較對照組及苯巴比妥+刺五加組大鼠平均逃避潛伏期顯著延長，穿越平臺象限有效區次數明顯減少，證明本次試驗中苯巴比妥干預后大鼠學習記憶功能受到損害，與以往研究結果一致。平臺象限路程與總路程之比較對照組小，但差異無統計學意義，考慮可能與樣本量少及實驗中的誤差有關。徐耀等[9]的實驗結果表明，刺五加皂甙可能通過抑制海馬區的血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達，而改善慢性腦缺血大鼠認知功能。郭冷秋等[10]對記憶障礙大鼠的研究表明，刺五加能明顯增強SD大鼠的記憶能力(尋找時間縮短，錯誤次數減少，認知率提高)，此作用可能與增強大鼠海馬區突觸可塑性有關。本實驗中苯巴比妥+刺五加組大鼠與對照組大鼠比較，平均逃避潛伏期及穿越平臺象限有效區次數差異無統計學意義，表明刺五加對未成熟腦起到了保護作用。

3.2 托吡酯對未成熟腦學習記憶的影響

托吡酯是吡南果糖氨基磺酸酯化合物，通過多種機制抗癲癇，是治療難治性癲癇的有效藥物之一，目前已經作為新型抗癲癇藥物在臨床中廣泛使用。托吡酯可用于治療部分性和全面性癲癇，尤其是難治性癲癇，臨床療效肯定。部分患者有記憶力下降、注意力不集中、言語流暢性降低、找詞困難等認知障礙[11]。李晶等[12]的研究發現可引起健康幼鼠學習記憶能力的損害，長程使用學習記憶能力損害較短程組更為明顯，與之相一致的是光鏡下托吡酯長程組海馬錐體細胞出現胞質濃縮、細胞膜皺縮等形態學改變，而托吡酯短程組及對照組無此現象，說明托吡酯對學習記憶能力損害可能與用藥時程有一定的關系。也有研究發現，生后7d的SD大鼠給予灌胃40mg/kg,連續給藥28d，35d時觀察海馬背側齒狀回顆粒細胞增殖、成熟及分化與正常對照組差異均無統計學意義[13]。除了有效的抗驚厥作用外，有研究證明托吡酯可以通過BDNF/TrKB依賴ERK通路的激活而衰減谷氨酸的毒性，起到保護海馬神經的作用[14]。研究還發現托吡酯在新生兒缺血性腦損傷中具有神經保護的作用，可以適度地提高癲癇新生兒的視覺-空間記憶能力[5]。有研究還發現，托吡酯的治療與認知功能障礙之間存在一定的劑量關系，低劑量(20mg/kg)、中劑量(40mg/kg)對學習記憶的影響不明顯，高劑量(80mg/kg)明顯抑制了癲癇大鼠的學習記憶能力[15]。本實驗結果顯示，與正常對照組比較，托吡酯干預組大鼠平均逃避潛伏期無顯著性差異，120s內平臺象限路程與總路程之比、穿越平臺象限次數差異無統計學意義。證明在未成熟腦短期使用中等劑量的托吡酯不會對未成熟腦遠期認知產生損害。對未成熟腦長期大劑量使用托吡酯是否會產生遠期的認知損害，出現行為學上的改變，有待進一步的研究。

[1]Silverstein F S,Jensen F E,Inder T,etal.Improv ing the treatment of neonatal seizures:National Institute of N euro log ical D isorders and Stroke workshop report[J].J Pediatr,2008,153(1):12-15.

[2]Serrano-Castro P J,Sánchez-Alvarez J C, Caadillas-Hidalgo F M,etal.Consensus clinical practice guidelines of the Sociedad Andaluza de Epilepsia for the diagnosis and treatment of patients with their first epileptic seizure in emergencies[J].Rev Neurol,2009,48(1):39-50.

[3]Kaindl A M, Asimiadou S, Manthey D,etal.Antiepileptic drugs and the developing brain[J].Cell Mol Life Sci,2006,63(4):399-413.

[4]羅小泉,駱利平,陳海芳,等.Morris水迷宮檢測大鼠記憶力方法的探討[J].時珍國醫國藥,2010,21(10):2667-2669.

[5]Pressler R M, Mangum B.Newly emerging therapies for neonatal seizures[J].Semin Fetal Neonatal Med,2013,18(4):216-223.

[6]Bath K G, Scharfman H E.Impact of early life exposure to antie￣pileptic drugs on neurobehavioral outcomes based on laboratory animal and clinical research[J].Epilepsy Behav,2013,26(3): 427-439.

[7]陳錦,蔡方成.抗癲癇藥對未成熟腦發育的影響[J].中華兒科雜志,2009,47(2):153-156.

[8]譚曉麗,師長宏,任穎鴿,等.大劑量苯巴比妥對驚厥幼鼠浦肯野細胞電生理功能的影響[J].中國病理生理雜志,2014,30(3):529-532,557.

[9]徐耀,肖璐,沈雪,等.刺五加皂甙對慢性腦缺血大鼠認知功能的影響[J].中華全科醫學,2013,11(12)1833-1834,1895.

[10]郭冷秋,郭壯麗,葉曉楠,等.刺五加總苷對REM睡眠剝奪所致大鼠記憶鞏固障礙及海馬群峰電位的影響[J].中國新藥雜志,2014,23(19):2304-2308,2315.

[11]Sommer B R,Mitchell E L,Wroolie T E.Topiramate:Effects on cognition in patients with epilepsy, migraine headache and obesity[J].Ther Adv Neurol Disord,2013,6(4):211-227.

[12]李晶,朱鳳蓮,盛凱,等.托吡酯對幼鼠學習記憶能力的影響[J].中華腦科疾病與康復雜志(電子版),2011,1(1):12-14.

[13]CHEN Jin,CAI Fang-cheng, CAO Jie,etal.Long-term antiepileptic drug administration during early life inhibits hippocampal neurogenesis in the developing brain[J].J Neurosci Res,2009,87(13):2898-2907.

[14]MAO Xiao-yuan, CAO Yong-gang, JI Zhong,etal.Topiramate protects against glutamate excitotoxicity via activating BDNF/TrkB-dependent ERK pathway in rodent hippocampal neurons[J].Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry,2015,60:11-17.

[15]李燕,唐洪麗,羅平香.托吡酯對發育期癲癇大鼠學習記憶能力及海馬組織GAP-43表達的影響[J].現代醫學,2008,36(6):381-384.

[專業責任編輯：劉小紅]

Influence of Phenobarbital and Topiramate on long-term learning and memory in Rats with immature brain and the protection effect of Acanthopanax

GE Li-ji1, YANG Lin2, HAN Ling1, LIU Yu2, QI Xue-hao3

(1.ShaanxiUniversityofChineseMedicine,ShaanxiXianyang712000,China; 2.SecondAffiliatedHospitalofMedicalCollege,
Xi’anJiaotongUniversity,ShaanxiXi’an710000,China; 3.Children’sHospitalofXi’anCity,ShaanxiXi’an710000,China)

Objective To observe the influence of Phenobarbital (PB) and Topiramate (TPM) on long-term learning and memory of newly-born rats by short-term administration and the protection effect of Acanthopanax. Methods There were two batches of rats. Among the first batch, 30 3-day old healthy Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into 3 groups, control group, PB group and PB combined with Acanthopanax group. Among the second batch, 30 3-day old healthy Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into 3 groups with 10 rats in each, control group, TPM group and TPM combined with acanthopanx group. Hypertonic saline (10mL·kg-1·d-1) was given to the control group, PB group was injected with PB (62.5mg·kg-1·d-1), and PB (62.5mg·kg-1·d-1) and Acanthopanax (5.6g·kg-1·d-1)were injected to PB combined with Acanthopanax group. TMP was injected to TMP group with the dose of 62.5mg·kg-1·d-1, and TMP combined with Acanthopanax group were given 62.5mg·kg-1·d-1of TMP and 5.6g·kg-1·d-1of Acanthopanax. The rats were injected after weighed for three continuous days. They were regularly fed till they were one month old. Finally 8 out of each group were selected to attend the game of Morris water maze. Results The incubation period for searching underwater platform in PB group was longer than the control group, and the difference was significant (t=-3.542,P=0.005). The times passing through the effective area reduced in PB group compared with the control group (t=3.352,P=0.005). However, after adding Acanthopanax, the incubation period (t=1.313,P=0.210) and the times passing through the effective area (t=0.051,P=0.128) had no significant difference from the control group. The incubation period for searching underwater platform in TPM group was significantly longer than the control group (t=-1.920,P=0.075), but the times passing through the effective area was less than the control group (t=1.915,P=0.076). However, TPM group was not significantly different from TPM combined with Acanthopanax group in incubation period (t=-0.597,P=0.560) and the times passing through the effective area (t=1.660,P=0.119). Conclusion Short-term use of PB in immature brain will damage long-term learning and memory, while Acanthopanax has protective effect. Short-term use of moderate dose of TPM in immature brain will not produce long-term learning and memory damage.

Phenobarbital (PB)；Topiramate (TPM)；Acanthopanax；immature brain；learning and memory

2014-12-08

國家自然科學基金資助項目(30973224)；醫院人才培養專項科研基金資助項目[RC(XM)200908]；陜西省科技公關資助項目[2006k15-G1(2)]

葛利吉(1977-)，女，主治醫師，在讀碩士研究生，主要從事小兒學習記憶的研究。

楊 琳，副教授。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.02.014

R720.597

A

1673-5293(2015)02-0207-03