Caspase3在羊水過少孕產婦血清中的表達

南延榮,解雁飛,薛瑞娟,張紅莉,南 剛,李 麗,李紅梅

(延安大學附屬醫院產科一病區，陜西 延安716000)

Caspase3在羊水過少孕產婦血清中的表達

南延榮,解雁飛,薛瑞娟,張紅莉,南 剛,李 麗,李紅梅

(延安大學附屬醫院產科一病區，陜西 延安716000)

目的 探討Caspase3在羊水過少產婦和羊水量正常的孕產婦血清中的表達差異。方法 采用酶聯免疫吸附法(ELISA)分別檢測30例羊水過少和30例羊水量正常孕產婦外周血中Caspase3表達水平的差異。結果 Caspase3蛋白在實驗組與對照組孕產婦的血清中均有陽性表達。實驗組血清中的Caspase3蛋白平均濃度(124.2±16.8)比對照組高(86.7±19.4)，其表達差異有統計學意義(t=2.28,P<0.05)，同時在羊水過少組血清Caspase3與羊水量表達水平呈負相關(rs=-0.45,P<0.05)。結論 羊水過少組孕產婦血清中Caspase3蛋白的高表達，提示Caspase3在孕產婦血清中的異常表達可能是羊水過少發生的原因之一。

孕產婦羊水過少；血清；酶聯免疫吸附法；孕產婦

羊水過少是妊娠期常見的妊娠合并癥之一，其定義為妊娠晚期羊水量少于300mL[1]。羊水量減少時，子宮與胎兒之間的緩沖減少，臍帶更容易受壓，同時胎肺發育受到影響，會使胎兒更容易發生胎心率異常及宮內缺氧等危及胎兒的情況[2-3]。目前大部分羊水過少的病因不清，羊水多少不是靜止不動的，而是處于循環狀態，因此研究羊水平衡的調控有著十分重要的意義。

近年來國內外學者開始將目光集中在參與細胞凋亡的因子在孕婦胎盤胎膜以及血清上的分布及其與羊水調節的關系。目前在婦產科領域，有關Caspase的研究多集中在妊娠期高血壓疾病及婦科腫瘤等方面，而有關與羊水過少的相關研究較少。Caspase3作為半胱氨酸蛋白酶家族中的一員，參與機體內細胞凋亡的過程，是執行人體中細胞凋亡程序的關鍵酶之一。其在妊娠婦女胎盤胎膜細胞中的正常表達,確保胎盤胎膜細胞的正常凋亡,從而維持著母胎之間的物質交換并保證胎兒的正常發育。因此本研究通過運用酶聯免疫吸附法進一步研究Caspase3在羊水量正常組孕婦和羊水過少組孕婦中血清的表達水平的差異，探討其與羊水量異常的關系，為尋找羊水量異常的病因與發病機制提供新的思路。

1 對象和方法

1.1 研究對象

選擇2013年6月至2013年9月在延安大學附屬醫院產科孕37～42周剖宮產分娩的羊水過少組產婦及正常組產婦各30例(羊水過少組初選入組為38例，剔除8例；正常組初選入組為41例，剔除11例)，兩組孕婦年齡、孕周、孕次和血清重量等均無顯著性差異，既往無內外科合并癥及其他妊娠合并癥(妊娠期高血壓疾病、胎膜早破、胎兒宮內生長受限、胎兒畸形及其他并發癥,近期無藥物服用史，感染及母體脫水等因素。羊水正常組剖宮產的指征有：前次剖宮產，頭盆不稱，產前B超檢測羊水指數(amniotic fluid index，AFI) ≤5.0cm和/或羊水最大暗區垂直深度(AFV)≤2cm，為羊水過少。剖宮產術中進一步核實羊水量，羊水總量<300mL確診為羊水過少。如果術中羊水量和術前羊水指數不相符，該病例予以剔除。

1.2 血清標本采集及ELISA方法

所有研究對象行剖宮產術前，常規消毒前臂，抽取5mL的靜脈血，立即將其注入已編號的未添加任何抗凝劑的潔凈試管內，隨后在室溫下靜置50min，待其自然凝固，然后將其置入離心機中分離15min后(轉速為2 000r/min)，依次用合適的移液器將上層透亮的血清移至己標號的潔凈聚丙烯管中，蓋緊后置于-70℃冰箱保存備用。ELISA 試劑盒購自北京博奧森生物工程有限公司，批內和批間變異系數均<9%。血清中Caspase3測定采用酶聯免疫吸附法，具體操作方法嚴格按照說明書操作。

具體步驟如下:

①標準品的稀釋：a.在酶標包被板上設標準品孔10孔，在第1、第2孔中分別加標準品100μL，然后在第1、第2孔中加標準品稀釋液50μL，混勻；b.然后從第1孔、第2孔中各取100μL分別加到第3孔和第4孔，再在第3、第4孔分別加標準品稀釋液50μL，混勻；c.然后在第3孔和第4孔中先各取50μL棄掉，再各取50μL分別加到第5、第6孔中，再在第5、第6孔中分別加標準品稀釋液50uL，混勻；d.混勻后從第5、第6孔中各取50μL分別加到第7、第8孔中，再在第7、第8孔中分別加標準品稀釋液50μL，混勻后從第7、第8孔中分別取50μL加到第9、第10孔中，再在第9第10孔分別加標準品稀釋液50μL，混勻后從第9第10孔中各取50μL棄掉。稀釋后各孔加樣量都為50μL，濃度分別為120ng/L，80ng/L，40ng/L，20ng/L，10ng/L);②加樣：分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μL，然后再加待測樣品10μL(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻；③溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘；④配液：將30(48T的20倍)倍濃縮洗滌液用蒸餾水30(48T的20倍)倍稀釋后備用；⑤洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干；⑥加酶：每孔加入酶標試劑50μL，空白孔除外；⑦溫育：操作同③；⑧洗滌：操作同⑤；⑨顯色：每孔先加入顯色劑A50μL，再加入顯色劑B50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘；⑩終止：每孔加終止液50μL，終止反應(此時藍色立轉黃色)。測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應在加終止液后15min以內進行。

1.3 結果判定

以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 兩組孕產婦年齡、妊娠周數及妊娠次數的比較

羊水過少組孕產婦年齡、妊娠周數及妊娠次數與對照組比較無顯著性差異，具有可比性。

表1 兩組孕產婦年齡、妊娠周數及妊娠次數的比較

2.2 Caspase3在兩組血清中的表達

羊水過少組血清Caspase3平均濃度為124.2±16.8ng/mL，正常組為86.7±19.4ng/mL。兩組孕產婦血清中Caspase3的濃度有顯著性差異(P<0.05),見表2。

表2 Caspase3在兩組血清中的表達情況

2.3 孕婦羊水量與其血清中Caspase3濃度關系

正常組孕產婦羊水量與血清Caspase3關系的相關系數rs=0.14，P>0.05，差異無統計學意義;而在羊水過少組其值為rs=-0.45,P<0.05，差異有統計學意義，提示正常組孕產婦羊水量與血清Caspase3表達并無相關性關系，而在羊水過少組羊水量與血清Caspase3表達水平呈負相關。

表3 孕婦羊水量與其血清中Caspase3濃度關系

3 討論

3.1 Caspase3的作用機制

凋亡因子Caspase家族在細胞凋亡程序中起著關鍵性作用。細胞凋亡普遍存在于自然界，對于維持人體的穩定性和保證人體的正常發育均具有重要的意義。一旦體內的凋亡機制發生異常將引起多種疾病的發生。Caspases在細胞內通常以無活性的酶原形式存在。一旦無活性的酶原被激活后，活化后的Caspases能特異性的識別底物，具有高度的特異性，保證了其在細胞凋亡程序中的專一性。同時Caspases之間還能相互激活，呈級聯反應，從而放大了其凋亡作用。

Caspase3即為半胱氨酸蛋白酶-3(天冬氨酸特異性的)。作為Caspases家族中最重要的成員之一，是細胞凋亡共同通路的效應分子，可誘導細胞凋亡。正常情況下，Caspase家族介導的細胞凋亡途徑有3種。但無論哪條通途，最終都匯合于效應Caspase ( 包括Caspase3、Caspase7)。研究者認為，Caspase7與Caspase3具有高度同源性，在細胞凋亡途徑中作用類似。Caspase7在N端有一氨基酸殘基片段，推測其必須先在Caspase3的作用下方能被激活而引發細胞凋亡。Caspase3一旦被激活就啟動凋亡程序，并以級聯放大方式傳導和放大凋亡信號，向下游凋亡執行因子傳遞，最終導致細胞凋亡。胰島素樣生長因子可調控Cyt-C釋放入胞質，從而抑制caspase3引發的細胞凋亡[4-10]。

3.2 Caspase3與羊水過少的相關研究

妊娠是一個特別復雜的生理過程,作為組織細胞更新的一種方式，正常孕婦的胎膜細胞在胎盤胎膜發育全過程中進行有序的細胞凋亡。Caspase3在正常妊娠胎膜絨毛滋養細胞的正常表達,確保正常胎膜細胞的凋亡,維持著母胎之間的物質交換及胎兒的正常發育。當Caspase3的表達異常時，將誘發細胞凋亡程序發生障礙，滋養細胞凋亡增加后，細胞體積縮小,從而導致大多數滋養細胞表面的水通道蛋白失活，不再介導水分子的跨膜運動,細胞對羊水的通透性下降，從而導致妊娠羊水過少的發生。因此，如果Caspase的表達異常是引起羊水過少的發病機制，那Caspase可作為一種新的治療羊水過少的手段。

本研究通過運用酶聯免疫吸附方法發現：Caspase3蛋白在羊水過少組產婦血清中的濃度明顯比另一組高。本課題組[11-12]還同時采用免疫組化方法(SP法)檢測這些研究對象胎盤胎膜中Caspase3蛋白的表達，結果發現：Caspase3蛋白在羊水過少組與羊水正常組產婦的胎盤胎膜中均有陽性表達，同時羊水過少組胎盤胎膜中的Caspase3的表達均比羊水正常組明顯升高。由此推測：在羊水過少組的孕婦胎盤胎膜及血清中Caspase3的表達增加可誘導胎盤胎膜細胞自身凋亡增加，干擾胎盤胎膜細胞的結構及其功能,從而使得胎盤的血管網形成不良，物質交換障礙,嚴重影響體內的水分子及其它小分子物質代謝及其循環，從而降低母體、胎兒及胎膜之間的水分子及其它小分子物質交換，導致羊水量減少。另外，胎盤胎膜細胞凋亡增加，影響胎盤胎膜細胞上水通道蛋白(AQP)的結構及其功能。水通道蛋白表達水平一旦下降，一方面減少母胎液體交換、胎兒血容量及胎兒皮膚腎臟水分排泄，減少羊水的生成。另一方面會改變細胞膜對羊水的通透性，阻止過多的液體重吸收進入胎兒血循環，在一定程度上減少羊水膜內途徑的重吸收，從而達到平衡羊水生成與吸收的目的。最后，AQP在胎盤胎膜組織中的表達減少可能參與胎盤老化及胎膜早破的病理分子機制。

3.3 展望

羊水過少的病因及發病機制至今尚未明確，Caspase3蛋白在羊水過少組孕婦的血清中的異常表達，為羊水過少的診斷及治療提供了新思路及重要參考價值,從而改善臨床結局，降低剖宮產率、圍生兒病率和死亡率，提高圍產醫學質量。但是它在羊水量的調節平衡中的確切作用機制有待于進一步研究，因此下一步我們期望通過制作動物模型及擴大樣本量對羊水過少進行多因素分析和研究，進一步尋找羊水過少發生的生物學特性，從而揭示其發生、發展的規律,最終為早預防、早診斷和早治療羊水過少提供新的方向。

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[專業責任編輯：楊文方]

Expression of Caspase3 in serum of pregnant women with oligohydramnios

NAN Yan-rong, XIE Yan-fei, XUE Rui-juan, ZHANG Hong-li, NAN Gang, LI Li, LI Hong-mei

(DepartmentofGynecologyandObstetrics,Yan’anUniversityAffiliatedHospital,ShaanxiYan’an716000,China)

Objective To explore the difference in Caspase3 expression in serum between pregnant women with oligohydramnios and normal pregnant women. Methods ELISA was performed to determine the concentration of Caspase3 expression in 30 cases of oligohydramnios (experimental group) and 30 normal cases (control group). Results Caspase3 in serum was positively expressed in two groups. The expression of Caspase3 was higher in the experimental group (124.2±16.8)than in the control group (86.7±19.4), and there was significant difference (t=2.28,P<0.05). At the same time the expression of Caspase3 showed a negative correlation with amniotic fluid volume in pregnant women with oligohydramnios (r=-0.45,P<0.05).Conclusion The high expression of Caspase3 in serum of pregnant women with oligohydramnios indicates that abnormal expression of Caspase3 might be one of the causes of oligohydramnios.

oligohydramnios；serum; enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)；pregnant women

2015-10-29

南延榮(1971-),女，副主任醫師，主要從事產科疾病的診治與研究。

李紅梅，教授。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.02.020

R714

A

1673-5293(2015)02-0228-03