SDF-1α通過p38MAPK-HIF-1α通路加強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制探討

薛寶瑤，趙 靜，張西愿，姜 霞，周 卓，于月成

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安710032)

SDF-1α通過p38MAPK-HIF-1α通路加強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制探討

薛寶瑤，趙 靜，張西愿，姜 霞，周 卓，于月成

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安710032)

目的 明確缺氧誘導(dǎo)因子-lα(HIF-1α)在基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(SDF-1α)調(diào)控的卵巢癌細(xì)胞遷移中的作用及其機(jī)制。方法 采用免疫組化分析HIF-1α在卵巢癌組織中的表達(dá)水平；將HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染SKOV3卵巢癌細(xì)胞，分別用SDF-1α和SDF-1α+SB203580處理，用RT-PCR及western blotting分析HIF-1α、p38MAPK的表達(dá)水平。結(jié)果 免疫組化分析表明，HIF-1α在卵巢癌組織中高表達(dá)，同時(shí)SDF-1α可明顯誘導(dǎo)HIF-1α的mRNA及蛋白水平的表達(dá)；當(dāng)用HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)水平明顯下降。當(dāng)用通路抑制劑SB203580處理后，SDF-1α誘導(dǎo)的HIF-1α水平明顯降低。結(jié)論 SDF-1α可通過p38MAPK-HIF-1α通路來調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的遷移。因此，該研究將為卵巢癌的防治提供新的研究方向。

基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α；絲裂原活化蛋白激酶通路；缺氧誘導(dǎo)因子-lα；卵巢癌；細(xì)胞遷移

基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(stromal cell-derived factor-1 alpha，SDF-1α)(趨化因子CXCL12)在腫瘤的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用，然而其具體的機(jī)制仍然不明。缺氧誘導(dǎo)因子-lα(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)被認(rèn)為在參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展等生物學(xué)方面起到重要作用，其源于HIF-1α上調(diào)了SDF-1α表達(dá)促進(jìn)了干細(xì)胞黏附、遷移[1]。本研究主要觀察和分析SDF-1α激活PI3K/AKT和MAPK通路促進(jìn)HIF-1α的表達(dá)，從而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，明確卵巢癌轉(zhuǎn)移機(jī)制，有望為卵巢癌的靶向治療提供新思路及臨床指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

人卵巢癌細(xì)胞SKOV3由第四軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞工程中心提供，McCoy’5A培養(yǎng)基購自Gibic；兔抗人HIF-lα多克降抗體、兔抗人p38、pp38多克隆抗體、SB203580購自美國Santa cruz公司，兔抗人β-actin抗體購自上海生工生物工程有限公司，DAB顯色劑(棕色)購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；脂質(zhì)體LipofeetamineTM 2000購自Invitroge，HIF-1α基因干擾片段由大連寶生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成；TRIzol試劑、real-time RT-PCR試劑盒購自TaKaRa，HIF-1α mRNA引物由Takara公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

將人卵巢癌細(xì)胞SKOV3置于含10%胎牛血清McCoy’5A培養(yǎng)基，37℃以及含有5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)，分為3組：A組卵巢癌細(xì)胞control，B組卵巢癌細(xì)胞加入外源SDF-1α，C組細(xì)胞轉(zhuǎn)染HIF-1α siRNA或細(xì)胞培養(yǎng)基中加入SB203580。

1.2.2 免疫組化染色

收集第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院病理科卵巢癌患者石蠟組織塊，制備切片，將石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化酶20min，枸櫞酸鈉煮沸修復(fù)抗原20min，加入兔抗人SDF-1α單克隆抗體、兔抗人HIF-1α單克隆抗體(1:200、4℃、過夜)，PBS洗片后二抗封閉40min，鏈霉親和素-過氧化物酶封閉40min，DAB顯色，蘇木素襯染、脫水、透明、封片。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.3 缺氧誘導(dǎo)因子-1α沉默RNA轉(zhuǎn)染

調(diào)整濃度SKOV3細(xì)胞(8～10)×104/L接種至6孔板，在含10%胎牛血清的McCoy’5A培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，細(xì)胞匯合度達(dá)到90%～95%。將稀釋好的HIF-1α siRNA和Lipofeetamine 2000試劑混合，形成HIF-1α siRNA/Lipofectamine 2000復(fù)合物。將HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染載體加到含有細(xì)胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)板孔中融合，然后放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。6h后換含10%胎牛血清的McCoy’5A培養(yǎng)基，20h恢復(fù)生長后，轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒Lipofeetamine 2000組作為對(duì)照，利用Western Blot檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)檢測

TRIzol法提取6孔板內(nèi)各組細(xì)胞的總RNA并定量；各樣本取3ng～3g總RNA，按TaKaRa公司試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成eDNA。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測，β-actin作為內(nèi)參照。PCR引物：HIF-1α正義鏈5-TTGCTCAT￣CAGTT￣GCCACTTCC-3，反義鏈5-AGCAATTCATCTGT￣GCTTTCATGTC-3。具體實(shí)驗(yàn)過程參考TaKaRa公司的real-time RT-PCR試劑盒進(jìn)行。

1.2.5 蛋白印跡法檢測

將細(xì)胞懸液經(jīng)離心、純化，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，勻漿中的各種成分會(huì)在凝膠中分開。之后，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF (polyvinylidene difluoride)膜上，加入第一抗體，孵育24h后，再加入第二抗體，后加入ECL (enhancer chemiluminescence)加強(qiáng)發(fā)光反應(yīng)。最后，將“膜”與X線片相重疊，反應(yīng)發(fā)出的光就會(huì)使X線片曝光，沖洗后可見所選擇蛋白所在的位置。通過蛋白印跡法檢測細(xì)胞中p38/pp38以及HIF-1α的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 缺氧誘導(dǎo)因子-1α在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)水平

免疫組化分析表明，HIF-1α在9例正常卵巢中無陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為0；HIF-1α在97例卵巢癌患者組織中65例呈陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為67.0%,HIF-1α在上皮性卵巢癌中的表達(dá)見圖1A、圖1B。

2.2 基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子-1α的表達(dá)

RT-PCR分析表明，SDF-1α刺激后可明顯誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3中HIF-1α的mRNA水平，見圖2，表明SDF-1α能夠促使卵巢癌細(xì)胞表達(dá)HIF-1α。

2.3 缺氧誘導(dǎo)因子-1α沉默RNA轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)水平的影響

Western blotting分析表明，HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中HIF-1α的蛋白水平明顯下降，見圖3，提示成功構(gòu)建HIF-1α沉默的細(xì)胞模型。

圖1A 圖1B

注：圖1A為陰性對(duì)照(SP×400)；圖1B為HIF-1α在卵巢癌患者組織中的陽性表達(dá)(SP×400)。

圖1 缺氧誘導(dǎo)因子-1α在上皮性卵巢癌中的表達(dá)

Fig.1 Expression of HIF-1α in ovarian cancer

圖2A 圖2B

注：圖2A為每組中20ng/mL SDF-1α 0、2、4、6和8h后各組中HIF-1α的mRNA水平；圖2B為每組中加入SDF-1α分別0、1、10、20和50ng/mL后各組中HIF-1α的mRNA水平。

圖2 SDF-1α誘導(dǎo)的HIF-1α在卵巢癌細(xì)胞株SKOV3中的表達(dá)水平

Fig.2 Expression level of HIF-1α induced by SDF-1α. in ovarian cancer cell line SKOV3

圖3 各組細(xì)胞中HIF-1α的蛋白表達(dá)水平

Fig.3 Protein expression levels of HIF-1α in each cell group

2.4 p38絲裂原活化蛋白激酶在基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α/缺氧誘導(dǎo)因子-1α誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞遷移中的作用

進(jìn)一步分析SDF-1α/HIF-1α誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞遷移的作用機(jī)制，Western分析表明，SDF-1α誘導(dǎo)p38MAPK的活化，見圖4A。當(dāng)用p38MAPK通路抑制劑SB203580處理后，細(xì)胞中SDF-1α誘導(dǎo)的HIF-1α的表達(dá)水平明顯受到抑制，見圖4B。

注：圖4A為各組細(xì)胞中pp38、p38的蛋白表達(dá)水平；圖4B為各組細(xì)胞中HIF-1α的蛋白表達(dá)水平。

圖4 pp38、p38及HIF-1α的蛋白表達(dá)水平

Fig.4 Protein expression levels of pp38, p38 and HIF-1α in each cell group

3 討論

3.1 趨化因子CXCR及其受體

趨化因子CXC受體(CXCR)是Gt類趨化因子，定位于第4號(hào)染色體，是完整的膜蛋白，可與CXC趨化因子家族成員特異性結(jié)合。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物有7種趨化因子受體，分別被命名為CXCRl～CXCR7。CXCRl和CXCR2密切相關(guān)，CXCRl的配基是人類CXCL8[也稱為白細(xì)胞介素(IL)-8]和CXCL6。CXCR2與CXCLl～CXCL7結(jié)合，CXCRl和CXCR2均表達(dá)在中性粒細(xì)胞表面，對(duì)中性粒細(xì)胞的趨化具有重要意義。CXCR3主要表達(dá)在T淋巴細(xì)胞和某些B淋巴細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞，細(xì)胞被激活后高表達(dá)，CXCR3有2種同種型：CXCR3-A和CXCR3-B，有3種高選擇性配基：CXCL9、CXCLl0和CXCLl 1(IFN 7、7 IP-10和Mig)，7 IP-10和Mig是CXC趨化因子超家族的2個(gè)成員，IFN 7可以極大程度地上調(diào)它們的表達(dá)。7 IP-10和Mig是CXCR3的功能性激動(dòng)劑。這兩種蛋白對(duì)NK細(xì)胞和活化T細(xì)胞有很強(qiáng)的激活作用，還介導(dǎo)IFN 7和脂多糖的作用及介導(dǎo)T細(xì)胞依賴的抗腫瘤作用[2]，趨化因子擁有40～50種蛋白質(zhì)的家族，CXCR與SDF-1α(基質(zhì)細(xì)胞來源因子，又名CXCL12)均為GPCR家族成員[3]，廣泛分部在中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞等造血細(xì)胞上。趨化因子對(duì)腫瘤發(fā)展進(jìn)程的調(diào)控主要通過與其受體結(jié)合完成的，趨化因子授予G蛋白偶聯(lián)的7次跨膜受體超家族。SDF-1α作為趨化因子家族成員之一，具有參與腫瘤細(xì)胞趨化性、血管生成及腫瘤轉(zhuǎn)移的功能，已成為近些年來的研究熱點(diǎn)。目前已有大量實(shí)驗(yàn)研究表明SDF-1α在多種癌癥中均有表達(dá)，可通過與其相應(yīng)的受體結(jié)合活化下游的信號(hào)通路，從而促進(jìn)了癌癥的侵襲、轉(zhuǎn)移[4]。本研究前期實(shí)驗(yàn)已證明SDF-1α通過與其受體CXCR4結(jié)合形成SDF-1α/CXCR4生物軸誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞的侵襲性與αvβ6的表達(dá)相關(guān)，αvβ6整合素通過活化p38 MAPK及PI3K/Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)下游uPA的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的侵襲性[5]。

3.2 缺氧誘導(dǎo)因子-1α及其與基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α之間的關(guān)系

HIF-1α被認(rèn)為是缺氧狀態(tài)下廣泛存在于哺乳動(dòng)物和人體內(nèi)的一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，它可激活相關(guān)目的基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。HIF-1α是由826個(gè)氨基酸組成，N端具有一個(gè)堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域(bHLH)和一個(gè)PAS(Per-ARNT-Sim)結(jié)構(gòu)域，這兩種結(jié)構(gòu)域共同參與靶基因上的低氧反應(yīng)元件結(jié)合，引起一系列反應(yīng)，利于腫瘤在缺氧條件下的能量代謝和氧輸送，為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供基礎(chǔ)。已有研究證明HIF-1α在卵巢癌組織中表達(dá)，提示HIF-1α對(duì)卵巢上皮癌的發(fā)生、發(fā)展起重要作用[6]。Mi-Kyoung Kim等[7]已證實(shí)，HIF-1α表達(dá)量的增加是依賴其上游的p38 MAPK信號(hào)通路的活化。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)想SDF-1α是否可通過p38 MAPK-HIF-1α通路來調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的遷移。結(jié)果顯示：HIF-1α在卵巢癌患者組織中的陽性表達(dá)率明顯增高，提示HIF-1α可能在卵巢癌的進(jìn)程中起著重要作用；RT-PCR分析表明，SDF-1α刺激后可明顯誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3中HIF-1α的mRNA水平，表明SDF-1α能夠促使卵巢癌細(xì)胞表達(dá)HIF-1α；Western分析表明，SDF-1α誘導(dǎo)p38 MAPK的活化，當(dāng)用p38 MAPK通路抑制劑SB203580處理后，細(xì)胞中SDF-1α誘導(dǎo)的HIF-1α的表達(dá)水平明顯受到抑制，提示SDF-1α通過激活p38 MAPK信號(hào)通路促進(jìn)其下游的HIF-1α表達(dá)，從而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。本研究明確了SDF-1α通過p38 MAPK-HIF-1α通路促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制，從而更好地為卵巢癌的靶向治療提供新的思路，對(duì)臨床診療起重要指導(dǎo)意義。

[1]Ceradini D J, Kulkarni A R, Callaghan M J,etal.Progenitor cell trafficking is regulated by hypoxic gradientsthrough HIF-1 induction of SDF-1[J].Nat Med,2004,10(8):858-864.

[2]薛剛,黃靜,張慧芹,等.三葉因子3和SDF-1/CXCR4生物軸在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及臨床意義[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2014,28(2):108-112.

[3]易良,卞修武.趨化因子及其受體在腫瘤血管生長中的作用及意義[J].國際病理科學(xué)與臨床雜志,2006,26(2):116-118.

[4]Heinrich E L, Lee W, Lu J,etal.Chemokine CXCL12 activates dual CXCR4 and CXCR7-mediated signaling pathways in pancreatic cancer cells[J].Journal of Translational Medicine,2012,10(1):68.

[5]XUE Bao-yao, WU Wei-guang, HUANG Kan,etal.Stromal cell-derived factor-1(SDF-1) enhances cells invasion by αvβ6 integrin-mediated signaling in ovarian cancer[J].Mol Cell Biochem,2013,380(1-2):177-184.

[6]陳素琴,高立亞,張英輝,等.卵巢上皮性腫瘤組織中HIF-1α與VEGF的表達(dá)及意義[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2005,21(6):669-672.

[7]Mi-Kyoung Kim, Hyun-Joo Park, Yong-Deok Kim,etal.Hinokitiol increases the angiogenic potential of dental pulp cells through ERK and p38MAPK activation and hypoxia-inducible factor-1α(HIF-1α) upregulation[J].Arch Oral Biol,2014,59(2):102-110.

[專業(yè)責(zé)任編輯：安瑞芳]

Stromal cell-derived factor-1 alpha(SDF-1α) enhances cells invasion by p38MAPK-HIF-1α mediated signaling in ovarian cancer

XUE Bao-yao, ZHAO Jing, ZHANG Xi-yuan, JIANG Xia, ZHOU Zhuo, YU Yue-cheng

(DepartmentofObstetricsandGynecology,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,ShaanxiXi’an710032,China)

Objective To observe the role and mechanism of hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α) in ovarian cancer cell migration regulated by stromal cell-derived factor-1 alpha (SDF-1α). Methods The expression of HIF-1α in cervical cancer was analyzed by immunohistochemistry. HIF-1α siRNA was transfected into ovarian cancer cell line SKOV3, and then treated with SDF-1α and SDF-1α+SB203580, respectively. The expression levels of HIF-1α and p38MAPK were confirmed by RT-PCR and western blotting. Results Immunohistochemical analysis showed that the expression of HIF-1α in ovarian cancer tissues was overexpressed, and that at the same time SDF-1α could induce the expression of mRNA and protein levels in HIF-1α. After transfected by HIF-1α siRNA, the HIF-1α expression level decreased obviously. When treated by SB203580, the expression level of HIF-1α induced by SDF-1α decreased significantly. Conclusion SDF-1α can regulate cells invasion by p38MAPK-HIF-1α mediated signaling in ovarian cancer. Therefore, this study will provide a new research direction for prevention and treatment of ovarian cancer.

stromal cell-derived factor-1 alpha(SDF-1α)；MAPK pathway；hypoxia inducible factor-1α；ovarian cancer；cells invasion

2014-07-09

薛寶瑤(1988-)，女，主治醫(yī)師，碩士研究生，主要從事婦科腫瘤的研究。

于月成，副教授/副主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.02.025

R737.33

A

1673-5293(2015)02-0243-03