苦參堿聯(lián)合順鉑對(duì)SiHa細(xì)胞TSLC1基因表達(dá)的影響

梁 歡，郭冠榮

(湖北省恩施土家族苗族自治州民族醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 恩施 445000)

苦參堿聯(lián)合順鉑對(duì)SiHa細(xì)胞TSLC1基因表達(dá)的影響

梁 歡，郭冠榮

(湖北省恩施土家族苗族自治州民族醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 恩施 445000)

目的 探討苦參堿聯(lián)合順鉑抑制人宮頸癌SiHa細(xì)胞及對(duì)肺癌腫瘤抑制因子1(TSLC1)基因表達(dá)的效果。方法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SiHa分為對(duì)照組、苦參組、順鉑組和聯(lián)合組，采用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MTT)測(cè)定4組聯(lián)合干預(yù)SiHa細(xì)胞2d后的抑制率；采用實(shí)時(shí)熒光定量(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)各組處理后TSLC1基因mRNA表達(dá)水平的變化。結(jié)果 對(duì)照組、順鉑組、苦參堿組和聯(lián)合組的SiHa細(xì)胞抑制率分別為0、61.24%、70.31%和74.20%，藥物干預(yù)組均高于對(duì)照組(t值分別為14.21、17.44、11.20，均P<0.05)，同時(shí)聯(lián)合組高于苦參堿和順鉑單獨(dú)干預(yù)(t值分別為4.47、3.21，均P<0.05)，而順鉑和苦參堿組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.71，P>0.05)。對(duì)照組、苦參堿組、順鉑組和聯(lián)合組干預(yù)SiHa細(xì)胞后TSLC1mRNA表達(dá)量分別為1.00±0.00μg/mL，23.53±0.01μg/mL，84.33±0.03μg/mL和90.23±0.01μg/mL，苦參堿組、順鉑組和聯(lián)合組干預(yù)組明顯高于對(duì)照組(z值分別為9.41、10.72、13.23，均P<0.05)，其中苦參堿組和聯(lián)合組TSLC1mRNA表達(dá)量組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(z=1.24，P>0.05)，但均高于順鉑組(z值分別為6.04、5.47，均P<0.05)；析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果表明順鉑和苦參堿均為SiHa細(xì)胞抑制率和TSLC1基因表達(dá)的影響因素，而且兩者存在交互作用，聯(lián)合應(yīng)用使效果增加。結(jié)論 苦參堿聯(lián)合順鉑能抑制人宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖，提高TSLC1mRNA表達(dá)量。

宮頸癌；SiHa細(xì)胞；苦參堿；順鉑；肺癌腫瘤抑制因子1

宮頸癌(cervical carcinoma)是婦科較為常見的惡性腫瘤之一，我國宮頸癌粗發(fā)病率為87/10萬，粗死亡率為20/10萬，均呈逐年上升的趨勢(shì)[1-2]。基礎(chǔ)研究表明，宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展涉及多種癌基因的激活、抑癌基因的失活。肺癌腫瘤抑制基因-1(tumor suppressor in lung cancer-1,TSLC1)在宮頸癌組織中表達(dá)降低或缺失，與癌組織的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此成為宮頸癌治療的熱點(diǎn)領(lǐng)域[3]。順鉑是宮頸癌化療使用最廣泛的藥物，而苦參堿作為一種具有潛在臨床價(jià)值的抗腫瘤中藥，對(duì)宮頸癌細(xì)胞也具有抑制增殖作用，劉暢[4]認(rèn)為苦參堿聯(lián)合順鉑能抑制人宮頸癌SiHa細(xì)胞生長(zhǎng)，機(jī)制可能與TSLC1mRNA表達(dá)上調(diào)有關(guān)。本研究嘗試進(jìn)一步探討苦參堿聯(lián)合順鉑對(duì)人宮頸癌SiHa細(xì)胞中TSLC1基因表達(dá)的影響，為宮頸癌治療提供更充足依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人宮頸癌SiHa細(xì)胞株由武漢大學(xué)提供，藥物與試劑包括：順鉑(國藥準(zhǔn)字H20043889，規(guī)格為6mL:30mg)，苦參堿(國藥準(zhǔn)字H20045238，規(guī)格為5mL:50mg)，TSLC1基因及β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)引物，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT，美國Sigma公司)，普朗品牌9602系列酶標(biāo)儀。人宮頸癌SiHa細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，溫度37℃，5%CO2飽和濕度，2～3d傳代1次。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞抑制率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SiHa細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)消化傳代后計(jì)數(shù)，將細(xì)胞密度調(diào)整為6×104/mL并以每孔100μL接種于96孔板，大部分細(xì)胞貼壁后分為對(duì)照組、苦參組、順鉑組和聯(lián)合組。對(duì)照組加入SiHa細(xì)胞液和四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)液，苦參堿組加入苦參堿至終濃度為250μg/mL，順鉑組加順鉑至終濃度為15μg/mL，聯(lián)合組加入250μg/mL苦參堿和15μg/mL順鉑。每組設(shè)6個(gè)平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)2d，各組每孔加入5mg/mL的MTT10μL，繼續(xù)孵育4h，小心吸去各個(gè)孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO，200μL)使結(jié)晶物充分溶解，振蕩15min，酶標(biāo)儀測(cè)定OD490nm處吸光光度值(A值)。對(duì)照組細(xì)胞活力為100%，計(jì)算各干預(yù)組對(duì)SiHa細(xì)胞增殖的抑制率，細(xì)胞抑制率(%)=(1-觀察組吸光度/對(duì)照組吸光度)×100%[4]。

1.2.2 肺癌腫瘤抑制基因-1mRNA的相對(duì)表達(dá)量

采用實(shí)時(shí)熒光定量(real-time fluorescence quantification，RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)經(jīng)藥物處理后TSLC1基因mRNA表達(dá)水平的變化。首先取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SiHa細(xì)胞，使用RNAisoTM Plus按照試劑盒說明書提取總RNA，取RNA以10μL體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，制備cDNA，并釋放30倍備用。RT-PCR擴(kuò)增儀檢測(cè)TSLC1mRNA相對(duì)表達(dá)定量。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃30s(預(yù)變性)，95℃5s，60℃30s，40個(gè)循環(huán)后終止。結(jié)果運(yùn)用RT-PCR 儀自帶軟件Rotor-Gene Real-Time Analysis Software 6.1 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組抑制率和mRNA表達(dá)結(jié)果

對(duì)照組、順鉑組、苦參堿組和聯(lián)合組的SiHa細(xì)胞抑制率均高于對(duì)照組(t值分別為14.21、17.44、11.20，均P<0.05)，同時(shí)聯(lián)合組高于苦參堿和順鉑單獨(dú)干預(yù)(t值分別為4.47、3.21，均P<0.05)，而順鉑和苦參堿組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.71，P>0.05)。3組藥物干預(yù)后TSLC1mRNA表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(z值分別為9.41、10.72、13.23，均P<0.05)，其中苦參堿組與聯(lián)合組TSLC1mRNA表達(dá)量組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(z=1.24，P>0.05)，但均高于順鉑組(z值分別為6.04、5.47，均P<0.05)，見表1和附圖。

表1 各組A值及抑制率

注：A：對(duì)照組；B：順鉑組；C：苦參堿組；D：聯(lián)合組。

附圖 相差倒置顯微鏡觀察SiHa細(xì)胞在不同組別中的變化

Fig. Variation of SiHa cells in different groups observed by inverted microscope

2.2 不同干預(yù)措施對(duì)抑制率和mRNA表達(dá)的影響

對(duì)影響SiHa細(xì)胞抑制率和TSLC1mRNA表達(dá)的因素進(jìn)行析因設(shè)計(jì)方差分析，結(jié)果顯示，抑制率和mRNA表達(dá)均受到順鉑和苦參堿影響，而兩種干預(yù)措施之間存在明顯交互作用，聯(lián)合使用時(shí)效果增強(qiáng)，見表2。

表2 A值和TSLC1 mRNA表達(dá)水平析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果

3 討論

3.1 肺癌腫瘤抑制基因-1與宮頸癌的關(guān)系

宮頸細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化、侵襲以及轉(zhuǎn)移能力獲得是一個(gè)逐漸演變的過程，目前認(rèn)為與原癌基因的激活和腫瘤抑制基因的失活有關(guān)。TSLC1基因是最初在肺癌中發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，在多種惡性腫瘤包括宮頸癌組織中表達(dá)缺失，說明其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)[5]。TSLC1編碼一種細(xì)胞黏附分子，不僅與抑癌蛋白相結(jié)合發(fā)揮抑癌作用，而且還參與細(xì)胞間的粘附作用和細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，對(duì)腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)行負(fù)調(diào)控，從而抑制宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展[6-7]。

3.2 順鉑和苦參堿治療宮頸癌的進(jìn)展

順鉑是鉑的金屬絡(luò)合物，通過破壞癌細(xì)胞DNA復(fù)制而發(fā)揮細(xì)胞毒作用。近年來研究證實(shí)，宮頸癌對(duì)順鉑治療較為敏感，以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合放化療對(duì)晚期及復(fù)發(fā)性宮頸癌療效確切[8]。苦參堿是我國傳統(tǒng)中藥苦參中提取出的一種主要活性成分，具有消炎抗菌、抗過敏、抗心率失常等多種藥理學(xué)作用，而目前的研究熱點(diǎn)集中于其抗腫瘤作用及其機(jī)制[9]，其可以通過絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路抑制真核細(xì)胞起始因子4E的磷酸化，從而抑制體外培養(yǎng)的宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖[10]。研究顯示，苦參堿能夠增加SiHa細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，而兩者均可以通過上調(diào)TSLC1的表達(dá)，起到對(duì)人宮頸癌SiHa細(xì)胞的抑制作用，進(jìn)一步影響宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[4,11]。

3.3 苦參堿聯(lián)合順鉑對(duì)SiHa細(xì)胞肺癌腫瘤抑制因子1基因表達(dá)的影響

本研究結(jié)果顯示，順鉑和苦參堿均能有效抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞和上調(diào)TSLC1基因的表達(dá)，而且兩者存在協(xié)調(diào)作用，聯(lián)合使用時(shí)療效增加，進(jìn)一步印證了苦參堿能夠增加SiHa細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。TSLC1基因甲基化是導(dǎo)致基因失活的重要機(jī)制，而TSLC1基因甲基化頻率在宮頸癌組織、子宮頸上皮內(nèi)瘤變組織、慢性炎癥組織中分別為66.2%、43.3%、6.9%，提示與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)[12]，但上調(diào)TSLC1基因的表達(dá)是否有助于活體腫瘤細(xì)胞的控制，有待臨床研究證實(shí)。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：安瑞芳]

Effect of matrine combined with cisplatin on the expression of tumor suppressor in lung cancer 1 gene in human cervical cancer SiHa cell

LIANG Huan, GUO Guan-rong

(EnshiTujiaandMiaoNationalitiesAutonomousPrefectureHospital,HubeiEnshi445000,China)

Objective To investigate the effect of matrine combined with cisplatin on inhibiting human cervical cancer SiHa cells and on tumor suppressor in lung cancer 1 (TSLC1) gene expression. Methods Logarithmic growth phase of SiHa cells were divided into control group, matrine group, cisplatin group and combination group. Inhibition rate was measured with MTT method. The change of TSLC1 gene mRNA expression was detected by RT-PCR process in each group. Results Inhibition rates of SiHa cells in the control group, matrine group, cisplatin group and the combination group were 0, 61.24%, 70.31% and 74.20%, respectively. The inhibition rates of medicine intervention groups were higher than the control group (tvalue was 14.21, 17.44 and 11.20, respectively, allP<0.05), and the combination group was higher than cisplatin and matrine group (tvalue was 4.47 and 3.21, respectively, bothP<0.05). There was no significant difference between cisplatin group and matrine group (t=0.71,P>0.05). The levels of TSLC1 mRNA expression after the intervention on SiHa cells in the control group, matrine group, cisplatin group and the combination group were 1.00±0.00μg/mL, 23.53±0.01μg/mL, 84.33±0.03μg/mL and 90.23±0.01μg/mL, respectively. Those of the medicine intervention groups were significantly higher than the control group (zwas 9.41, 10.72 and 13.23, respectively, allP<0.05). There was no significant difference between matrine group and the combination group in TSLC1 mRNA expression level (z=1.24,P>0.05), but both of them were higher than cisplatin group (zvalue was 6.04 and 5.47, respectively, bothP<0.05). Factorial design analysis of variance showed that cisplatin and matrine were influencing factors of inhibiting SiHa cells and TSLC1 gene expression. There was an interaction effect between them so that it generated increasing effect by combination.Conclusion Matrine combined with cisplatin can inhibit the proliferation of human cervical cancer SiHa cells and improve TSLC1 mRNA expression level.

cervical cancer; SiHa cells; cisplatin; matrine; tumor suppressor in lung cancer-1(TSLC1)

2014-07-08

梁 歡(1983-)，女，主治醫(yī)師，碩士研究生，主要從事中醫(yī)婦科臨床工作。

郭冠榮，主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.02.026

R711.7

A

1673-5293(2014)02-0246-02