生物信息學(xué)在預(yù)測和鑒定變形鏈球菌非編碼RNA 中的應(yīng)用*

夏 麗 王成龍 儲冰峰

變形鏈球菌是革蘭氏陽性的兼性厭氧菌，是口腔主要的致齲細(xì)菌之一。變形鏈球菌主要的毒力是利用食物中的葡萄糖產(chǎn)酸，利用蔗糖合成胞外多糖進(jìn)行粘附[1]。

細(xì)菌非編碼RNA(small non-coding RNA，sRNA)是一類長度在50-500 個核苷酸，不能編碼蛋白質(zhì)的RNA。sRNA 有諸多功能，在細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、RNA 的加工與修飾、mRNA 的穩(wěn)定性與翻譯、以及蛋白質(zhì)的降解、質(zhì)粒的復(fù)制、細(xì)菌的應(yīng)激反應(yīng)和毒力等[2，3]方面發(fā)揮重要作用。生物信息學(xué)是根據(jù)sRNA 的特點進(jìn)行計算機系統(tǒng)預(yù)測，使sRNA 不再是偶然被發(fā)現(xiàn)[4-7]。sRNA 的特點包括：比較基因組學(xué)的特點，其序列位于基因間區(qū)，在相近菌種間具有序列同源性；熱動力學(xué)中保守的二級結(jié)構(gòu)；特定的轉(zhuǎn)錄信號，包括有σ70啟動子，可預(yù)測的內(nèi)在終止子。

隨著對基因組研究的深入，Dragana 等[4]獲得了變形鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株UA159 的基因組序列，對變形鏈球菌的環(huán)境適應(yīng)及毒力相關(guān)基因有大量研究，但是調(diào)控機制并不清楚。本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測變形鏈球菌UA159 的sRNA，對部分可能存在的序列進(jìn)行實驗初步篩選，生物信息學(xué)鑒定。

1. 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)方法預(yù)測 各種生物信息學(xué)預(yù)測方法不同，預(yù)測結(jié)果變化較大。下面介紹本實驗使用的4 種生物信息學(xué)預(yù)測方法。

1.1.1 sRNAPredict sRNAPredict 是第一個使用轉(zhuǎn)錄信號的位置特點預(yù)測sRNA 序列的軟件[5]，特點包括：啟動子信號，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，由TRANSTERMHP 預(yù)測的ρ-非依賴性終止子[6]，通過BLAST(Basic Local Alignment Search Tools)進(jìn)行同源性分析。這一方法可以用于預(yù)測不知道啟動子序列的新sRNA。

1.1.2 SIPHT SIPHT 是進(jìn)行sRNA 大規(guī)模預(yù)測的生物信息學(xué)方法。該方法運用高通量技術(shù)(high-throughput technology，SIPHT)，采用自動工作流程，首先從美國國立生物技術(shù)信息中心

(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫獲得所有細(xì)菌的復(fù)制子，進(jìn)而預(yù)測sRNA 的編碼基因，由Condor DAGMan’s高通量計算系統(tǒng)進(jìn)行運算。

1.1.3 sRNASVM sRNASVM 是根據(jù)大腸桿菌sRNA 特點，基于機器學(xué)習(xí)方法編程，進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測的方法。利用已知的細(xì)菌sRNA基因構(gòu)建訓(xùn)練集，提取描述訓(xùn)練集中每個樣本的特征向量，采用機器學(xué)習(xí)的方法構(gòu)建sRNA 預(yù)測模型，預(yù)測出細(xì)菌特有的sRNA。

1.1.4 網(wǎng)站Oral pathogens non-coding small RNA prediction 名為Oral pathogens noncoding small RNA prediction 的網(wǎng)站針對口腔細(xì)菌進(jìn)行sRNA 預(yù)測。

1.2 RT-PCR 初步檢測

1.2.1 菌株 變形鏈球菌UA159 標(biāo)準(zhǔn)菌株為本室保存。

1.2.2 實驗方法

細(xì)菌總RNA 的提?。喝捬醮蠦HI 培養(yǎng)的變形鏈球菌菌液2ml，離心收集細(xì)菌，用0.1%DEPC 水洗滌一次。將細(xì)菌重懸于100μl 含5g/ L溶菌酶的TE(pH=8.0)緩沖液中，置于冰上15-20min。細(xì)胞溶液中加入20μl 10%SDS，置于沸水1min。于冰上冷卻并加入100μl Trizol 吹打混勻，加入20μl 氯仿，劇烈震搖15s。室溫靜置3-5min 后，于4℃，12000rpm 離心15min。吸取上層液相，移至新管，加入等體積異丙醇，顛倒混勻，置于-70℃沉淀過夜。4℃微量離心機，12000rpm 離心20min，可見RNA 在管底形成白色沉淀；吸棄上清，加入1ml 80%乙醇，顛倒混勻，于4℃，7500rpm 離心5min；棄上清，于室溫晾干沉淀，用42μl DEPC 水溶解RNA；-70℃保存。

RT-PCR 檢測：取2.5μg 所提總RNA 進(jìn)行加尾，加入5×M-MLV Buffer 5μl，100mM ATP 0.25μl，RNA2.5μg，PAP0.25μl，RNA 酶抑制劑0.5μl，DEPC 水補至21μl，37℃水浴1h。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄通用引物RT-Primer：

5’-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’，將加尾產(chǎn)物中加入dNTP (2.5mM)2.5μl，M-MLV0.5μl，RT-Primer(500ng/ μl)1μl，42℃水浴1.5h，保存于-20℃。PCR 檢測反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的sRNA，引物為sms1f：AATCAGCCTTTAGCTTTGATAC，sms2f：CTAAGACAGCAGGGGAGCGT，sms3f：TTTCTCCTCTCGTCTATT，sms4f：TGAATACGCCTACGACTCTGTG， sms5f： TATTCCTTTAACACTGTCC，QmiR-reverse：GCGAGCACAGAATTAATACGAC；反應(yīng)條件：95℃10min；94℃30s，54℃30s，72℃30s，擴增30個循環(huán)；72℃10min。熒光定量PCR反應(yīng)條件： 95℃10min； 95℃30s，54℃30s，72℃30s，擴增40 個循環(huán)；95℃60s，54℃30s，95℃30s，采集熔解曲線。

1.3 sRNA 序列的家族鑒定 Rfam 數(shù)據(jù)庫是用序列比對和協(xié)方差統(tǒng)計的方法對非編碼RNA進(jìn)行家族分類[18]。進(jìn)入Rfam 網(wǎng)站http:/ / rfam.xfam.org/ ，輸入sRNA 序列，系統(tǒng)自動分析[19]，網(wǎng)頁跳轉(zhuǎn)至分析結(jié)果頁面。

2. 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)軟件預(yù)測結(jié)果 通過sRNAPredict，SIPHT，sRNASVM，網(wǎng)站Oral pathogens non-coding small RNA prediction 4 種方法預(yù)測變形鏈球菌UA159 的非編碼RNA。sRNAPredict 預(yù)測得到14 條序列，SIPHT 預(yù)測得到226 條序列，sRNASVM 預(yù)測得到132 條序列，網(wǎng)站 Oral pathogens non-coding small RNA prediction 預(yù)測得到37 條序列。其中SIPHT，sRNA Predict 和sRNASVM 三種方法預(yù)測得到4條相同序列；SIPHT，sRNASVM 和網(wǎng)站三種方法預(yù)測得到1 條相同序列；SIPHT 和sRNA Predict 兩種方法預(yù)測得到10 條相同序列；sRNASVM 和網(wǎng)站兩種方法預(yù)測得到9 條相同序列；SIPHT 和網(wǎng)站兩種方法預(yù)測得到6 條相同序列；SIPHT 和sRNASVM 兩種方法預(yù)測得到10條相同序列。4 種生物信息學(xué)方法共得到334 條不同sRNA 序列，有40 條序列是至少兩種生物信息學(xué)方法預(yù)測得到。

2.2 RT-PCR 檢測部分預(yù)測的sRNA 通過不同生物信息學(xué)方法預(yù)測的sRNA 中，有40 條序列是至少兩種生物信息學(xué)方法預(yù)測得到。采用RT-PCR 檢測這40 條sRNA 序列，其中5 條存在RT-PCR 產(chǎn)物(圖1)。

圖1 RT-PCR 檢測出的5 條sRNA 電泳圖注：從左到右分別為pUC18 Marker，sms1，sms2，sms3，sms4，sms5。

2.3 sRNA 序列的家族鑒定 通過Rfam 網(wǎng)站分析5 條RT-PCR 檢測得到的sRNA 序列(表1)。sms2 序列屬于L10-Leader 家族(RF00557)，sms5序列屬于PyrR家族(RF00515)。 sms1，sms3，sms4 未檢測到相近的家族序列，可能為新發(fā)現(xiàn)的sRNA。

表1 經(jīng)RT-PCR檢測得到的5 條sRNA 序列

3. 討論

生物信息學(xué)預(yù)測方法是常用的系統(tǒng)性尋找sRNA 的方法之一。最初的sRNA 是在實驗中偶然發(fā)現(xiàn)的，隨著發(fā)現(xiàn)的增加，對已發(fā)現(xiàn)的sRNA基因特點加以總結(jié)和推算，發(fā)展出各種生物信息學(xué)方法預(yù)測sRNA。目前主要由以下四個方面進(jìn)行預(yù)測[7]：一是比較基因組學(xué)，二是二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，三是轉(zhuǎn)錄單元預(yù)測，四是機器學(xué)習(xí)方法。本研究通過4 種方法得到了變形鏈球菌sRNA 生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果。其中sRNAPredict，SIPHT 和網(wǎng)站

Oral pathogens non-coding small RNA prediction

都屬于轉(zhuǎn)錄單元預(yù)測的方法，sRNASVM 則是機器學(xué)習(xí)的模擬方法。轉(zhuǎn)錄單元預(yù)測方法的基本假設(shè)是sRNA 基因在相近物種的基因組中具有一定的序列保守性和結(jié)構(gòu)保守性，有已知的啟動子和終止子單元。雖然是同樣的原理，但編寫軟件的方法不同，對參數(shù)的設(shè)定不同，會造成預(yù)測結(jié)果存在差別，所以在研究中雖然采用了3 種轉(zhuǎn)錄單元預(yù)測的方法，其重復(fù)的序列并不多?；跈C器學(xué)習(xí)的方法進(jìn)行的生物信息學(xué)預(yù)測是采用機器學(xué)習(xí)方法構(gòu)建sRNA 預(yù)測模型，對基因組中新的sRNA 進(jìn)行預(yù)測。但這種方法需要對DNA 片段進(jìn)行窗口化處理，而sRNA 的序列長度變化較大，很難選擇最佳的窗口大小[8]，使得機器學(xué)習(xí)方法構(gòu)建的sRNA預(yù)測模型的陽性檢出率(positive prediction value，PPV)不是很高[9]?？偟恼f來，生物信息學(xué)方法是根據(jù)已知的sRNA 序列特點，對基因組信息完整的細(xì)菌，通過不同的運算方法來預(yù)測，可以獲得大量的sRNA 信息，但這些序列還是需要實驗學(xué)方法進(jìn)行驗證。在本研究中，用4 種生物信息學(xué)方法進(jìn)行預(yù)測，對其中40 條序列進(jìn)行RT-PCR 初步檢測，得到5 條序列，其中3 條來自sRNASVM 和網(wǎng)站兩種方法預(yù)測得到的相同序列，2 條來自SIPHT 和網(wǎng)站兩種方法預(yù)測得到的相同序列。

目前也有研究采用基因芯片對sRNA 進(jìn)行全面檢測，基因芯片可以獲得所有轉(zhuǎn)錄的RNA 序列，再通過大量的數(shù)據(jù)分析，得到sRNA 序列。但是一些sRNA 只在特定的環(huán)境中表達(dá)，對于這一部分sRNA 就很難檢測到。在對化膿性鏈球菌sRNA 的研究中[10]，同時采用生物信息學(xué)預(yù)測和基因芯片進(jìn)行研究，總共預(yù)測出了75 條sRNA，其中只有7 條是兩種方法都檢測到的。

生物信息學(xué)方法預(yù)測和基因芯片檢測sRNA，都是對全基因組進(jìn)行sRNA 篩選，二者各有側(cè)重。生物信息學(xué)方法更加方便快捷，省時省力，只需要提供細(xì)菌的基因組信息就可以完成，與sRNA 是否在特殊環(huán)境表達(dá)無關(guān)；基因芯片則需要提供細(xì)菌的RNA，受實驗方法和技術(shù)的限制，與sRNA 是否在特殊環(huán)境下表達(dá)密切相關(guān)，但檢測得到的序列真實性更高。不管是基因芯片，還是生物信息學(xué)方法，都需要進(jìn)一步通過實驗驗證。

4. 結(jié)論

生物信息學(xué)在變形鏈球菌sRNA 的研究中發(fā)揮了重要作用，預(yù)測了大量可能存在的序列，對相關(guān)序列進(jìn)行分析鑒定，與實驗相輔相成，相互驗證。目前生物信息學(xué)的預(yù)測結(jié)果還不夠全面準(zhǔn)確，隨著實驗的不斷深入，生物信息學(xué)也會快速發(fā)展，為研究提供更多可靠的結(jié)果。

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