響應曲面優化固定化微生物修復石油污染土壤

張 涵，韓雨彤，張守娟，丁 錚，張秀霞

(中國石油大學 環境與安全工程系， 山東 青島266580)

響應曲面優化固定化微生物修復石油污染土壤

張 涵，韓雨彤，張守娟，丁 錚，張秀霞

(中國石油大學 環境與安全工程系， 山東 青島266580)

采用秸稈載體DG吸附高效石油降解菌SJ5-1制備固定化微生物。在花盆中模擬固定化微生物修復石油污染土壤，采用單因素實驗考察wC∶wN∶wP(有機質、全氮、速效磷的質量分數的比值)、含水率、接種量對石油烴降解率的影響，再通過Design-Expert 8.06響應曲面法設計實驗，建立多元二次回歸方程預測模型，進一步確定固定化微生物的最佳實驗參數組合，并在最佳參數條件下驗證模型的準確性。結果表明，預測模型準確；在土壤含油率為4.72%(質量分數)時，固定化微生物修復35 d，響應面優化得到固定化微生物最佳降解條件為wC∶wN∶wP=100∶9.79∶1，接種量10.34%、含水率17.8%(質量分數)，石油烴降解率為42.4%，高于單因素最優條件時的40.8%；對石油烴降解率影響的顯著性從大到小的因素依次是接種量、含水率、wC/wN。

固定化微生物；石油污染土壤；響應面；優化條件

隨著石化工業的發展，在石油勘探、開采、運輸及儲存過程中，由于意外事故或管理不當，導致石油排放到土壤田間，使土壤環境遭受污染，直接危害人類生產與生活。20世紀80年代以前，土壤修復方法主要是物理法和化學法。由于難以大規模實施、對土壤結構造成破壞、產生二次污染等缺陷[1]，限制了這兩種方法的應用。20世紀80年代以來，生物修復技術因其無污染、無毒害得到了人們的重視[2]，在土壤修復領域中取得了很大進步。然而，傳統微生物修復技術往往對多變的環境條件抵抗力弱，導致降解效率不高。秸稈在土壤中易被生物降解、來源廣，不僅對土壤結構無害，而且可改善土壤理化性質，應用在土壤修復中是一種理想的土壤調理劑和微生物的載體[3-4]。近年來，秸稈載體[5-7]的固定化微生物在石油污染土壤修復中脫穎而出。關于固定化微生物在土壤中降解條件的優化研究尚少，研究多集中在制備條件等方面。有學者提出修復土壤工程啟動前，需要調節土壤條件[8-9]，以保證微生物高效修復。

響應面法(Response surface method，RSM)是通過對響應曲面及等高線的分析，利用多元二次回歸方程來擬合響應值與各因素之間的函數關系[10]，依此從響應曲面上找到最佳控制點，尋求最優工藝參數。與正交法相比，響應面法可以連續地對試驗因素的各個水平進行分析，在實驗設計與結果表達方面具有較大的價值，在污染修復中的應用[7,11]也有相關報道。

筆者采用前期篩選出的天然有機秸稈DG為載體，采用吸附法制備固定化微生物。利用響應曲面法優化降解條件，考察各自變量及其交互作用對降解效果的影響，建立多元二次回歸方程，得出降解優化條件，為秸稈固定化微生物在土壤修復的應用提供技術參數。

1 實驗部分

1.1 供試土壤

供試土壤為新疆風城油田作業區附近被石油污染的土壤。對其進行風干，去除粒徑大的植物殘體和砂礫，碾碎，貼標簽，裝瓶置于4℃冰箱，備用。

1.2 供試菌種

所用菌種為實驗前期篩選出的原油降解菌SJ5-1。菌落呈黃褐色、圓形、大小均勻、邊緣整齊，革蘭氏陰性，無芽孢，吲哚實驗、淀粉水解實驗、甲基紅實驗均為陰性，接觸酶實驗為陽性，初步鑒定為無色桿屬(Chromobacter)細菌。

1.3 實驗方法

1.3.1 固定化微生物制備

取已粉碎、篩分至40目的秸稈載體DG裝入錐形瓶中，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。將其與石油高效降解菌SJ-1活化好的菌液按體積比1∶5混合，于30℃、160 r/min搖床培養24 h。倒掉上層培養基，用生理鹽水將載體材料轉移到離心管中，在離心機中1000 r/min下離心5 min后，棄去上清液。重復2次，離心所得沉淀即為固定化微生物[7]。

1.3.2 固定化微生物的生物量測定

將2.0 g固定化微生物加入錐形瓶中，加入50 mL無菌水，于160 r/min培養0.5 h。取上層菌液1 mL以10倍為1個梯度進行稀釋，涂布平板，培養，計數。游離菌培養液中細菌數量的確定亦取1 mL菌液稀釋，涂布平板計數。計算1 mL游離菌菌液與1 g固定化微生物細菌數量之間的關系。得到固定化微生物生物量為8.08×1012個/g，游離菌液細菌數量9.42×1011個/mL，等生物量換算，8.08×1012/(9.42×1011)=8.58 mL/g，即1 g固定化微生物相當于8.58 mL游離菌菌液。

1.3.3 土壤和秸稈理化性質測定

采用超聲-萃取紫外分光光度法[12]測定土壤石油烴含量；采用重量法測定土壤含水率；參考國家標準NY/T 1377-2007，采用電極電位法(pHS-3酸度計)測定土壤pH值；采用重鉻酸鉀容量法測定土樣的有機質含量；采用半微量凱氏法測定土樣的總氮含量；采用鉬銻抗比色法測定土樣的速效磷[13]。

土壤及秸稈的理化性質見表1。

表1 供試土壤及秸稈的理化性質

1.3.4 單因素實驗

實驗選取wC∶wN∶wP、含水率、固定化微生物接種量3個因素。通過單因素實驗考察各個因素對原油降解率的影響，分別確定固定化微生物降解率最好的降解條件。

(1)在4個相同花盆中分別裝500 g土樣。以摩爾比為1的硫酸銨和硝酸鈉為氮源，磷酸二氫鉀為磷源，溶于少量水中。根據實驗室的前期研究，調節土壤wC∶wN∶wP(有機質、全氮、速效磷的質量分數比)為100∶2∶1、100∶5∶1、100∶10∶1、100∶20∶1，添加固定化微生物接種量10%(1 g土樣含0.1 mL游離菌)(根據等生物量換算結果，按500 g土樣含50 mL游離菌計算固定化微生物添加量)，含水率維持在20%左右[14]。每天澆水、翻耕，在30℃的恒溫培養箱中培養35 d，每7 d測定土壤石油烴含量，得出最佳wC∶wN∶wP。

(2)為了考察固定化微生物對土壤含水率的適應范圍，設置含水率分別為8%、14%、18%、23%(質量分數)的土壤，采用(1)實驗中得出的wC∶wN∶wP，接種量10%，修復35 d，得出最佳含水率。

(3)為了避免實際應用中降解效率不高及降解菌和載體的浪費，實驗確定最佳的固定化微生物接種量。分別向土壤中添加5%、10%、15%、20%的固定化微生物，采用 (1)、(2)實驗得出的wC∶wN∶wP、含水率， 修復35 d，得出最佳接種量。

1.3.5 響應面優化實驗

采用響應面優化Box-Behnken Design(BBD)實驗設計模型，按wC∶wN∶wP、含水率、接種量3個因素對修復效果的影響進行優化實驗，利用回歸方程優化實驗條件，確定石油烴降解率最高時的實驗條件組合。

2 結果與討論

2.1 單因素對固定化微生物修復污染土壤石油烴降解率的影響

2.1.1wC∶wN∶wP的影響

初始含油率為4.72%的供試土壤，在不同wC∶wN∶wP條件下，固定化微生物修復35 d，石油烴降解率隨時間的變化如圖1所示。

從圖1可以看出，固定化微生物的石油烴降解率隨時間的延長而增大，補充氮源、磷源，降解效果明顯。wC∶wN∶wP為100∶2∶1、100∶5∶1、100∶10∶1、100∶20∶1時，在初始含油率為4.72%的土壤石油烴降解率分別為25.1%、28.1%、34.9%、26.5%。隨著N源的增加，石油烴降解率也隨之增加，wC∶wN∶wP比為100∶10∶1時降解率達到最大值；N源繼續增大，降解率反而降低，說明N源過多，會影響石油烴的降解率。

圖1 不同wC∶wN∶wP下固定化微生物修復污染土壤的石油烴降解率隨時間的變化

微生物對氮源的敏感度大[15-17]，氮源含量過低，不能滿足微生物的需要，限制了微生物活性，導致石油烴降解率較低；秸稈固定化微生物的加入，對土壤的N源有一定的貢獻值；wC∶wN∶wP為100∶20∶1，氮源過高，碳源不足，造成氮源的浪費，不利于石油烴的降解。因此，秸稈DG固定化微生物修復石油污染土壤時應保持營養物質的平衡，才能達到高效降解的效果。

2.1.2 含水率的影響

初始含油率為4.72%的供試土壤，在不同含水率的條件下，固定化微生物修復35 d，石油烴降解率隨時間的變化如圖2所示。

從圖2可以看出，在不同含水率下，石油烴降解率隨著固定化微生物修復時間的延長呈不同程度增大。含水率在18%時，降解率最高達到38.5%；含水率23%左右時，降解率反而最低。微生物的生長繁殖離不開水，土壤含水率過低，土壤中微生物不活動，達不到生長的需求，微生物的呼吸作用減弱，影響對石油烴的降解[18]；土壤含水率適宜，水分子在土粒周圍形成水膜，切斷或阻礙了石油烴與土壤顆粒間的聯系、吸附，同時微生物可以進入水膜內，增加了與石油的接觸機會，使微生物得以繁殖，能夠在油水界面活躍生長，可高效降解石油烴。23%左右時，實驗中觀察到土壤已經成泥漿的狀態，妨礙 O2的擴散，使好氧微生物缺氧而死亡，導致降解率較低[19]，僅為26.3%，與含水率為14%時的降解率28.4%相差不大。說明固定化微生物修復石油污染土壤時適宜的含水率應該維持在14%～23%之間，最好是18%左右。

圖2 不同含水率下固定化微生物修復污染土壤的石油烴降解率隨時間的變化

保持土壤適宜的水分有利于改善修復效果，特別是干旱或半干旱地區需要適時適量的補充水分，才能維持固定化微生物對石油烴的高效降解。

2.1.3 固定化微生物接種量的影響

初始含油率為4.72%的供試土壤，在不同接種量下，固定化微生物修復35 d，石油烴降解率隨時間的變化如圖3所示。

土壤中微生物是石油烴降解的動力與主體。從圖3可以看出，不同微生物接種量的土壤中石油烴降解率變化規律基本一致，隨著降解時間的延長，石油烴降解率也增加。修復35d，接種量為5%、10%、15%、20%的石油烴降解率分別為23.3%、39.4%、34.7%、26.4%，10%接種量的降解率最高。說明在一定范圍內，接種量增多會提高降解率，超過此范圍，接種量增多反而不利于石油烴的降解。

接種固定化微生物能夠提高土壤的微生物數量，提高外接的石油降解菌與土著菌的競爭能力，使石油降解菌迅速適應環境，大量繁殖，發揮高效降解能力[20]。接種量與石油烴降解率并不是呈單一的正比例關系，當接種量過多，土壤營養物質不足，造成高效降解菌之間存在空間、營養上的競爭，導致降解率降低；另外，降解產生的代謝產物可能會降低微生物與石油烴的接觸，也導致降解率降低。接種量過低，微生物數量與土著菌的競爭力不強，接入土壤中會有一部分微生物因為不適應而死亡，導致降解率很低，所以適宜的接種量對石油污染土壤修復具有重要的作用。本實驗優選出最佳固定化微生物接種量為10%。

圖3 不同接種量下固定化微生物修復污染土壤的石油烴降解率隨時間的變化

在wC∶wN∶wP為100∶10∶1、含水率18%、接種量為10%的最佳條件下，固定化微生物修復35 d后，石油烴降解率達40.8%。

2.2 固定化微生物降解條件的響應面優化

2.2.1 響應面優化實驗結果

根據單因素實驗得出的結果,以wC/wN、含水率、接種量分別為自變量A、B、C，以35 d石油烴降解率為響應值Y，進行17個實驗點(5個中心點)的響應面優化實驗。響應面實驗因素與水平設計表如表2所示。

表2 固定化微生物降解條件的響應面實驗因素與水平

向17個相同的花盆中分別加入0.5 kg供試土壤，按照表3的實驗安排，于30℃恒溫箱內培養35 d。每天加水翻耕，保持充足的空氣和水分，35 d后取土樣測含油率，得出石油烴降解率。響應曲面各系數方差分析表列于表3。

當模型的模型顯著系數“Prob>F”值小于0.05時，表示該項指標影響顯著；小于0.01時，表示該項指標影響非常顯著。失擬項表示模型的誤差，失擬項系數為0.0937，大于0.05，表示模型在誤差范圍之內。

表3 本實驗數據的二次響應面模型和方差分析

從表3可以看出，該模型的模型顯著系數為<0.0001，表示非常顯著；該模型的R2=0.9979，說明該模型的擬合度較好，精確度較高，可以用來分析和預測結果。從表3還看出，各一次項系數和二次項系數A、B、C、AB、AC、A2、B2、C2的影響非常顯著(“Prob>F” 值 小于0.01)，但是BC不顯著(“Prob>F”值為0.2459，大于0.05)。對石油烴降解率影響的顯著性從大到小依次是接種量、含水率、wC/wN。

以固定化微生物35d石油烴降解率為響應值，利用軟件Design expert 8.06對Box-Behnken的實驗結果進行二次多項回歸擬合，各因素與響應值之間的關系可用二次多元回歸方程表示，如式(1)所示。

Y=41.7+0.65A-0.87B+1.09C+0.96AB+

1.49AC-0.35BC-8.22A2-7.90B2-8.57C2

R2=0.9979(1)

式(1)中，Y為石油降解率的預測值，A、B、C分別是土壤的wC/wN、含水率以及固定化微生物接種量。

2.2.2 響應曲面圖分析

根據等高線和三維圖可以分析固定化微生物對石油污染土壤的石油烴降解率與各因素關系，并能夠看出各因素存在的交互作用及最佳的降解條件，如圖4所示。

從圖4(a)可看出，隨著wC/wN增大，固定化微生物對石油污染土壤的石油降解率先緩慢后快速增大，超過一定比值后快速減小，wC/wN為10左右時降解率最大；隨含水率增大，石油降解率先快速增大后快速減小，含水率18%左右時降解率最大。

從圖4(b)看出，隨著wC/wN增大，固定化微生物對石油污染土壤的石油烴降解率緩慢增大后減小；隨接種量增大，降解率先增大后減小。結合表4的方差分析，接種量對石油降解率的影響最大，如果在wC/wN充足時，適當添加外源菌有助于提高降解率。接種量在10%左右降解率最大。

從圖4(c)看出，隨著含水率增大，固定化微生物對石油污染土壤的石油烴降解率緩慢增大后減小；隨接種量增大，降解率快速增大后減小，說明接種量對降解率的影響最大。如果在土壤水分充足條件下，接入外源菌能提高降解率。

圖4 wC/wN和含水率、 wC/wN和接種量、含水率和接種量對污染土壤石油烴降解率相互作用的響應面

由此可見，wC/wN、含水率、接種量不是越大越利于石油烴的降解，它們對降解率的影響作用不同；3個因素存在顯著的相互作用，存在最佳的組合，使得降解率達到最高。將二次多元回歸方程求導，取降解率極大值點時的最佳實驗參數，得到wC/wN=10.21、含水率17.8%、接種量10.34%，此時石油烴降解率的理論值達41.8%。

2.2.3 響應曲面模型驗證

為了對模型的準確性進行驗證，在上述實驗條件下進行花盆模擬實驗，于30℃的培養箱中修復35 d，得到石油烴降解率42.4%，與模型結果41.8%較接近，說明響應面優化法模型能很好地預測石油污染土壤的修復效果，比單因素實驗得出最佳組合條件下的降解率大，但是相差不大。

3 結 論

(1)單因素實驗得出，固定化微生物修復石油污染土壤的最佳條件為wC∶wN∶wP=100∶10∶1，含水率18%、接種量10%。任何一種因素過大或過小都會對石油烴降解不利。

(2)根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，通過響應面設計實驗，建立了wC/wN、含水率、接種量與固定化微生物修復石油污染土壤的石油烴降解率之間關系的數學模型，該模型為Y=41.7+0.65A-0.87B+1.09C+0.96AB+1.49AC-0.35BC-8.22A2-7.90B2-8.57C2，R2=0.9979，模型回歸效果顯著。

(3)在含油率為4.72%時，響應面優化得到的固定化微生物修復石油污染土壤的最佳條件為wC∶wN∶wP=100∶9.79∶1，接種量10.34%、含水率17.8%。在此條件下，修復35 d得到的石油烴降解率為42.4%，比單因素實驗得出的最佳組合條件下的結果高1.6%。對石油烴降解率影響的顯著性從大到小的因素依次是接種量、含水率、wC/wN。

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Optimization for Petroleum-Contaminated Soil Remediated by Immobilized Microorganisms Using Response Surface Method

ZHANG Han，HAN Yutong，ZHANG Shoujuan，DING Zheng，ZHANG Xiuxia

(DepartmentofEnvironmentalandSafetyEngineering,ChinaUniversityofPetroleum,Qingdao266580,China)

Straw DG was used as carrier material for petroleum hydrocarbon degrading strain SJ5-1 to prepare immobilized microorganisms. In indoor flowerpot, the remediation of petroleum-contaminated soil by immobilized microorganisms was simulated, and the impacts ofwC∶wN∶wP, moisture content and the inoculum amount on hydrocarbon degradation rate were investigated by single factor experiment. Then the response surface method was used to design the experiment, by which a prediction model of quadratic polynomial regression equation was obtained to determine the optimal parameter arrangement. Under the optimized parameter arrangement, the model was verified. The results indicated that the model was proved veracious. By controlling the immobilized microorganisms inoculum being 10.34%,wC/wN=10.21, moisture content being 17.8% according to response surface analysis, the best degradation rate of 42.4% was obtained, which was higher than the best result of 40.8% obtained under the optimal conditions based on single factor experiment. The significance order of influence on hydrocarbon degradation rate from high to low was the inoculum amount, moisture content,wC/wN.

immobilized microorganisms; petroleum-contaminated soil; response surface method; optimum condition

2014-03-03

山東省自然科學基金(ZR2014BM023)、中國石油科技創新基金(2009D-5006-07-01)、青島市科技發展指導計劃項目(KJZD-12-65-jch)、中央直屬高校科研專項基金(11CX05011A)、中國石油大學(華東)研究生創新工程(CX-1219)和(CX2013035)資助

張涵，女，碩士，主要研究石油污染土壤修復；E-mail:zhanghan 199101@163.com

張秀霞，女，教授，博士，主要從事石油污染土壤修復研究 ；E-mail:zhxiuxia@upc.edu.cn

1001-8719(2015)04-1028-07

X53

A

10.3969/j.issn.1001-8719.2015.04.029