口服普萘洛爾對嬰幼兒血管瘤相關生長因子及凋亡因子表達水平的影響

李銘，郭志輝，謝義德，周亞寬，陳小松，江成鴻，詹明坤，王立敏

口服普萘洛爾對嬰幼兒血管瘤相關生長因子及凋亡因子表達水平的影響

李銘，郭志輝，謝義德，周亞寬，陳小松，江成鴻，詹明坤，王立敏

目的觀察口服普萘洛爾對嬰幼兒血管瘤病灶內相關生長因子及凋亡因子表達水平的影響。方法選擇2010年5月－2011年12月收治的年齡≤3個月、血管瘤病灶位于肢體或隱蔽部位、家屬要求手術治療但具備單獨口服普萘洛爾治療條件、排除用藥禁忌證、先前未接受過任何治療的病例作為研究對象，共39例。所有患者均在局麻下夾取血管瘤體組織活檢，然后口服普萘洛爾(每次1mg/kg，每12h服藥一次)8周，繼而手術切除瘤體。通過HE染色觀察用藥前后組織結構及細胞形態的變化，采用免疫組化、實時熒光定量RT-PCR檢測用藥前后病灶組織內ADRB1、ADRB2、ERK、Akt、NF-κB、VEGFA、Cyclin D1、Cyclin E1、Ki-67、Bax、Bcl-2、caspase-8、Fas、FasL、caspase-9、caspase-3表達水平的變化，并分別用CD34、Ki-67免疫組化染色及TUNEL染色檢測用藥前后病灶內新生血管密度(MVD)、細胞增殖情況(Ki-67陽性率)以及細胞凋亡指數。結果與用藥前比較，口服普萘洛爾后血管瘤病灶內ADRB1、ADRB2、ERK、Akt、NF-κB、VEGFA、Cyclin D1、Cyclin E1、Ki-67、Bcl-2表達水平明顯下降(P<0.01)，Bax、caspase-3、caspase-9表達水平明顯增高(P<0.01)，Fas、FasL、caspase-8表達水平無明顯改變(P>0.05)。與用藥前比較，用藥后病灶內MVD、Ki-67陽性率明顯下降(P<0.01)，凋亡指數明顯增高(P<0.01)。結論普萘洛爾可通過調節MAPKs和PI3K-Akt通路抑制血管瘤增殖，促進內源性凋亡，但對外源性凋亡途徑無明顯影響。

普萘洛爾；血管瘤；血管生成蛋白質類；凋亡誘導因子

嬰幼兒血管瘤是嬰幼兒最常見的良性腫瘤，發病率約為10%[1]，自然病程多分為3個階段，即快速生長期、穩定期、消退期，約50%的患兒血管瘤在5歲前可完全消退，到9歲前這一比例可達90%[2-3]。盡管血管瘤大多能夠自限，但其對嬰幼兒的潛在危害卻不能忽視，如迅速增大并累及重要組織器官，出現破潰、出血、感染等并發癥。因此目前仍主張對嬰幼兒血管瘤采取適當、有效的治療措施[4]，選擇治療方案的原則為以最小的代價控制瘤體生長，尤其是不進一步破壞容貌，或形成新的醫源性損害。目前針對嬰幼兒血管瘤的治療方案主要有手術切除、口服激素、局部注射平陽霉素、同位素敷貼、激光治療等，但均存在一定的局限性[5]。2008年法國Bordeaux兒童醫院Léauté-Labréze等[6]報道普萘洛爾可顯著抑制嬰幼兒血管瘤，其后又有數篇文獻報道2～3mg/(kg.d)的普萘洛爾對血管瘤有明顯治療效果[7-15]。由于普萘洛爾副作用相對較小，應用于兒童至今尚無死亡及嚴重心血管事件的報道，因此迅速成為臨床治療嬰幼兒血管瘤的首選方案[16]。Léauté-Labréze等[6]通過臨床觀察發現患兒治療后短期內即明顯見效，出現瘤體變薄，顏色變淺，表面皺縮，皮溫下降，推測普萘洛爾可能通過改變瘤體血管的血流動力學特性、減少局部供血而發揮作用，但目前仍沒有系統的關于其治療機制的文獻報道。本課題組在臨床觀察中還發現，患兒在治療滿一個療程后未見復發，且有患者中途停止治療但瘤體仍繼續消退[15]，這些現象無法單純用血流動力學原理解釋。本研究擬通過測定口服普萘洛爾前后血管瘤病灶內血管內皮細胞的增殖、凋亡水平及相關因子表達是否存在差異，探討普萘洛爾能否在體內抑制血管瘤血管內皮細胞增殖并促進其凋亡，并對其相關機制進行初步探討。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2010年5月－2011年12月福建醫科大學附屬協和醫院整形外科收治的年齡≤3個月、血管瘤病灶位于肢體或隱蔽部位、家屬要求手術治療但具備單獨口服普萘洛爾治療條件、排除用藥禁忌證(如哮喘等)、先前未接受過任何治療的病例作為研究對象，共39例，其中男16例，女23例，年齡57.6±11.3d(小33d，最大2個月零3周)。經過與家屬溝通并獲得書面同意，治療前先按口服普萘洛爾診療常規，局部消毒鋪巾，用皮膚活檢槍在局麻下夾取血管瘤體組織，后口服8周鹽酸普萘洛爾片(河南天方藥業股份有限公司生產，每次口服劑量為1mg/kg，每12h服藥一次)，繼而手術切除瘤體。本治療及研究經本院倫理委員會核準。

1.2 主要試劑

1.2.1 免疫組化試劑 鼠抗人CyclinD1、CyclinE1、NF-κB、Bax、Bcl-2、VEGFA、CD34、Fas、FasL、caspase-8、caspase-9、caspase-3單克隆抗體(福州邁新)，鼠抗人ADRB1、ADRB2、ERK、KT單克隆抗體(美國Sigma)，辣根過氧化物酶標記羊抗鼠單克隆抗體(北京中杉金橋，PV9002)，DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋)，中性樹脂。MIB-1(用于Ki-67檢測)、末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT，用于TUNEL檢測)為福州邁新產品。

1.2.2 Real-time RT-PCR試劑 Trizol(TaKaRa RNAiso plus)，反轉錄試劑盒(TaKaRa PrimeScript? RT reagent Kit，DRR037A)，熒光定量試劑盒(TaKaRa SYBR? Premix ExTaqTMⅡ，DRR820A)，內參引物(TaKaRa Human-GAPDH-Primer，B702A)，其余引物由TaKaRa公司合成，具體序列見表1。

1.3 主要儀器 Applied BioSystems 2720 Thermal Cycler PCR儀，Applied BioSystems 7500熒光定量PCR儀， Thermo NANO DROP 1000分光光度計，Eppendorf Centrifuge 5430R高速低溫離心機，Nikon顯微鏡及攝像頭。

1.4 方法

1.4.1 組織材料處理 每例治療前及治療后的標本收集后用PBS溶液洗凈，切取1～2mm3小塊，置入液氮罐內凍存，其余標本浸入4%中性甲醛溶液內固定。

1.4.2 HE染色 常規組織塊脫水透明，浸蠟包埋，4μm切片，置于70℃恒溫烤箱1.5h；常規脫蠟及水化，PBS沖洗2min×3次，蘇木素染色2min，1%鹽酸乙醇分化，流動雙蒸水沖洗30min，伊紅染色2min，流動雙蒸水沖洗30min；常規梯度乙醇脫水、透明，中性樹脂封固，光鏡下觀察組織及細胞形態特點并拍照。

表1 實時熒光定量RT-PCR引物序列Tab. 1 Primers used for real-time RT-PCR

1.4.3 免疫組化檢測 選擇PBS代替一抗作為陰性對照，選擇已確定陽性表達的樣本作為陽性對照，參照PV9002試劑盒說明書進行操作。將4μm組織切片置于70℃恒溫烤箱中1.5h，常規脫蠟及水化，滴加3%過氧化氫去離子水溶液，室溫孵育4min；抗原修復液中熱修復2min；滴加一抗，室溫孵育2h；滴加聚合物輔助劑，室溫孵育15min；滴加辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠IgG抗體(二抗)，室溫孵育15min；每步驟之間用PBS溶液沖洗3min×5次。滴加DAB顯色5min，雙蒸水中洗滌5min；蘇木精復染2～3min，1%鹽酸乙醇分化，雙蒸水沖洗10～15min；常規梯度乙醇脫水、透明，中性樹脂封固，鏡下觀察并拍照。應用Image Pro Plus 6.0軟件，選擇每張切片的空白處進行校正后，測定互不重疊的4個400倍視野下陽性反應的平均積分光密度、陽性反應面積，計算陽性面積率。

1.4.4 RNA提取及實時熒光定量RT-PCR檢測 提取各樣本組織RNA，RNA純度及濃度要求：A260/A280介于1.85～2.00，濃度≥100ng/μl。不符合者重新提取RNA。按照DRR037A反轉錄試劑盒說明，配置80μl反轉錄反應體系，按37℃ 15min、85℃ 5s、4℃的程序進行反轉錄。將獲得的cDNA樣本參照DRR820A熒光定量試劑盒說明書在96孔PCR反應板上配制標準20μl反應體系，各樣品均設3個復孔，然后置于熒光定量PCR儀內，按兩步法標準PCR擴增程序進行反應(95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 34s，循環40次；95℃ 15s；60℃ 1min；95℃ 15s)。保存并確認Real-time PCR的擴增曲線和融解曲線。將cDNA樣本按10倍梯度稀釋后，繪制標準曲線，計算擴增效率。各待測基因相對于內參GAPDH的相對表達量按下列公式計算，結果以中位數/四分位間距表示。1/相對表達量=其中Etarget為待測基因擴增效率，Ct-target為待測基因Ct值，EGAPDH為內參擴增效率，Ct-GAPDH為內參Ct值。

1.4.5 微血管密度(MVD) 先在200倍視野下挑選微血管內皮細胞染色清晰、背景對照良好的區域，然后在400倍視野下計數10個互不重疊的視野中血管內皮細胞CD34陽性血管數目，管腔≥8個紅細胞直徑和含管壁肌層的血管不進入計數。單個棕黃色內皮細胞或細胞簇計為1個血管。剔除染色不清、難以分辨的細胞。取10個視野的平均值作為該切片的MVD值。

1.4.6 Ki-67陽性率 每張Ki-67陽性切片選取5個陽性細胞(細胞核中見深棕色顆粒者)最多、互不重疊的400倍視野，計算100個血管內皮細胞中陽性細胞所占的百分比。未見陽性細胞的切片記為0。

1.4.7 凋亡指數(AI) 每張TUNEL陽性切片選取5個陽性細胞(細胞核中見深棕色顆粒者)最多的、互不重疊的400倍視野，計算500個血管內皮細胞中陽性細胞所占的百分比。未見陽性細胞的切片記為0。

1.5 統計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。平均積分光密度、MVD結果以表示，用藥前后差異的比較采用配對t檢驗；陽性面積率、AI、Ki-67陽性率以M(Q)表示，用藥前后差異的比較采用配對樣本的Wilcoxon符號秩和檢驗；各待測基因的相對表達量以M(Q)表示，用藥前后差異的比較采用REST 2009軟件進行分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HE染色結果 口服普萘洛爾治療前所有血管瘤病灶均呈現典型的增生期特征，新生血管排列致密，部分內皮細胞呈團塊狀增生，血管內皮細胞胞核肥大而淡染。治療后病灶部分區域開始呈現退化期特征，血管排列較治療前稀疏，血管腔增大，周圍結締組織或脂肪組織浸潤增多(圖1)。

圖1 口服普萘洛爾治療前后血管瘤病灶組織的變化(HE ×400)Fig. 1 Hemangiomas lesions before and after oral propranolol treatment (HE ×400)

2.2 免疫組化染色結果

2.2.1 CD34染色結果與MVD計數情況 CD34主要表達于血管內皮細胞胞質中。口服普萘洛爾前病灶內新生血管致密，可見部分內皮細胞呈團塊狀增生，胞質內有大量濃密棕黃色顆粒，計算MVD值為96.3±18.4。口服普萘洛爾8周后病灶內新生血管密度明顯降低，管腔增大，周圍結締組織增多，內皮細胞胞質內棕黃色顆粒濃度較前降低，計算MVD值為42.3±12.8。配對t檢驗顯示用藥前后MVD值差異有統計學意義(t=18.458，P<0.01，圖2)。

圖2 口服普萘洛爾治療前后血管瘤病灶內CD34的表達情況(免疫組化 ×400)Fig. 2 Expression of CD34 in hemangiomas lesions before and after oral propranolol treatment (Immunohistochemistry ×400)

2.2.2 Ki-67染色情況及Ki-67陽性率 Ki-67主要表達于血管內皮細胞胞核內，陽性反應呈深棕色團塊狀(圖3)。39例患者用藥前Ki-67陽性率為44.5%(10.7%)，用藥后為10.3%(4.3%)，差異有統計學意義(Z=–5.442，P<0.01)。

圖3 口服普萘洛爾治療前后血管瘤病灶內Ki-67的表達情況(免疫組化 ×400)Fig. 3 Expression of Ki-67 in hemangiomas lesions before and after oral propranolol treatment (Immunohistochemistry ×400)

2.2.3 TUNEL染色情況及AI TUNEL陽性反應主要位于細胞核內，偶可見于細胞間，呈深棕色或黑色顆粒狀。39例患者用藥前AI(中位數/四分位間距)為0.70%/0.65%，用藥后為21.20%/15.85%，差異有統計學意義(Z=–5.442，P<0.01)。

2.2.4 其他免疫組化染色結果 ADRB1、ADRB2主要在血管內皮細胞胞膜表達，胞質內亦有表達，口服普萘洛爾治療后表達水平有所下降。ERK、Akt、VEGFA、Bcl-2四種蛋白均主要定位于血管內皮細胞胞質內，用藥后胞質內棕黃色顆粒減少。Bax、caspase-9、caspase-3三種蛋白亦主要定位于胞質內，但用藥后胞質內棕黃色顆粒增加。NF-κB、Cyclin D1、Cyclin E1三種蛋白均定位于血管內皮細胞胞核內，用藥后表達水平下調(胞核內棕黃或深棕褐色染色減少)。經統計學分析，上述蛋白治療前后表達水平差異均有統計學意義(P<0.01)，而Fas、FasL、caspase-8蛋白表達在用藥前后差異無統計學意義(表2)。

表2 口服普萘洛爾治療前后免疫組化檢測結果(n=39)Tab.2 Immunohistochemical findings of hemangiomas before and after oral propranolol treatment (n=39)

2.3 Real-time RT-PCR檢測結果 各樣本各指標擴增曲線均到達平臺期，3個復孔重復性良好。融解曲線形成高窄單峰，未檢測到引物二聚體形成。REST 2009軟件分析顯示，與口服普萘洛爾治療前比較，用藥后血管瘤組織中ADRB1、ADRB2、ERK、Akt、VEGFA、NF-κB、Cyclin D1、Cyclin E1、Bcl-2 mRNA表達水平明顯下降，Bax、caspase-9、caspase-3 mRNA表達水平明顯上升，差異均有統計學意義(P<0.01)，Fas、FasL、caspase-8 mRNA表達水平無明顯改變(數據略)，與免疫組化染色變化趨勢一致。

3 討 論

目前研究認為，血管瘤發生的基本機制是血管生長及修復紊亂，其主要特征是毛細血管內皮細胞增生[17]，但確切的發病機制未完全明確[18]。目前普遍認可的觀點是血管瘤的發生發展與VEGF等促血管生成因子高表達有關[19]。有研究發現VEGF、Cyclin D1、Cyclin E、Ki-67的轉錄及表達在血管瘤增生期均明顯高于消退期，且增生期血管瘤內皮細胞及其鄰近上皮細胞的VEGF、Cyclin D1、Cyclin E、Ki-67表達水平明顯高于遠處上皮細胞，說明病變部位VEGF等因子高表達是增生期血管瘤內皮細胞異常增殖、瘤體快速增長的原因之一[20-24]。Chen等[25]研究證實VEGF可通過細胞膜VEGFR-2受體激活PKB，再通過PI3K-Akt途徑激活后續信號調控血管內皮細胞的增殖和分化。Cyclin D1、Cyclin E是重要的細胞周期調控蛋白，其中Cyclin D1高表達可使血管內皮細胞G1期縮短，體積變小，對分裂原的依賴性減弱，快速通過G1/S檢查點，加速從G1期到S期的轉換，促進細胞的分裂、增生；Cyclin E高表達出現在G1期晚期、S期早期，其過表達可激活CDK2，同樣加速G1/S期轉換，促進細胞的分裂、增生[26]。Ki-67的表達與細胞增殖狀態密切相關，已作為衡量組織增殖水平的指標在惡性腫瘤的診斷中廣泛應用，同時還可客觀反映血管瘤內皮細胞的增殖功能。在血管瘤消退期，VEGF、Ki-67表達均明顯下降，而Fas/FasL、caspase-3表達水平明顯增高，同時TUNEL標記的凋亡細胞明顯增多，證實消退期血管瘤內皮細胞大量凋亡，并很可能與Fas/ FasL通路有關[20-24]。

普萘洛爾是第一個應用于臨床的非選擇性β受體阻滯劑，其左旋異構體可通過可逆性地與β1、β2腎上腺素能受體結合，產生穩定細胞膜結構的藥理學作用，以及降低心率、降低心輸出量、收縮外周血管、降低外周血管血流量的臨床效應，目前在臨床上主要用于各種快速性心律失常、心絞痛、高血壓、嗜鉻細胞瘤等的治療。有學者在體外培養的胃癌細胞株檢測到β1、β2腎上腺素受體表達，在胰腺癌細胞株檢測到β2受體表達[27-28]。β受體作為G蛋白偶聯受體，在與普萘洛爾或ICI 118551(選擇性β2受體阻滯劑)等受體阻滯劑結合后，其下游Ras和Src酪氨酸激酶依賴的MAPKs通路和PI3K-Akt通路被阻斷，從而抑制ERK和Akt磷酸化，使NF-κB表達下調，減少其與細胞核內相應增強子元件結合，下調以VEGF為主的多種細胞因子基因的轉錄。同時ERK為介導Cyclin D1表達所必需的重要通道，其表達減低可抑制Cyclin D1表達，阻斷細胞由G1期進入S期。同時，ERK和Akt磷酸化受抑制及VEGF等生長因子表達水平減低，可使Bad發生去磷酸化而活化，Bax表達上升，Bcl-2表達下降，促使線粒體細胞色素C釋放，并且激活caspase-9和caspase-3，產生促凋亡作用[27-32]。

本研究發現，在口服普萘洛爾治療前，嬰幼兒血管瘤組織亦有β1、β2腎上腺素受體蛋白及其mRNA表達，而口服普萘洛爾8周后，病灶組織內兩種受體蛋白表達及mRNA轉錄水平較前下降，同時 ERK、Akt、NF-κB、VEGFA、Cyclin D1、Cyclin E1、Ki-67、Bcl-2等作為β受體下游因子的基因轉錄及蛋白表達水平也出現下降，Bax、caspase-9因子的基因轉錄及蛋白表達水平上升，AI上升，差異有統計學意義，提示普萘洛爾在蛋白質修飾以及基因轉錄水平均可阻斷β受體下游的MAPKs和PI3K-Akt胞內信號傳導通路，抑制ERK和Akt磷酸化，使NF-κB表達下調，減少以VEGF為主的多種細胞因子的表達，同時還可抑制Cyclin D1、Cyclin E1的表達，阻斷細胞由G1期進入S期。另外，普萘洛爾通過抑制ERK和Akt磷酸化以及降低VEGF等生長因子的表達水平，使Bad發生去磷酸化而活化，Bax表達上升，Bcl-2表達下降，促使線粒體細胞色素C的釋放，并且激活caspase-9和caspase-3，通過內源性凋亡途徑促進血管瘤組織內血管內皮細胞凋亡，從而抑制血管瘤病灶的增殖。這可能是普萘洛爾治療嬰幼兒血管瘤的重要機制之一。

本研究還發現，在口服普萘洛爾治療后，嬰幼兒血管瘤病灶內β1、β2腎上腺素受體mRNA相對表達量下降幅度明顯大于積分光密度值、陽性面積率下降幅度，提示β1、β2腎上腺素受體mRNA表達水平下降較受體蛋白表達水平下降明顯，且β2下降比例更大，具體機制不明，但考慮與口服普萘洛爾治療療效呈“先快后慢”的臨床特點有關。當β1、β2腎上腺素受體表達量下降后，普萘洛爾作為β受體阻滯劑的作用位點減少，抑制血管瘤發展的效應也相應減低。因而在臨床上可以觀察到，應用普萘洛爾治療嬰幼兒血管瘤早期，血管瘤瘤體顏色轉暗、瘤體表面張力減低較為明顯、迅速，隨后瘤體消退速度逐漸減慢，甚至出現消退停滯的“耐藥”現象。

此外，本研究中免疫組化和實時熒光定量RTPCR結果均提示，口服用藥治療前后Fas、FasL、caspase-8表達水平無明顯差異，且FasL蛋白表達水平及基因豐度均較低，考慮普萘洛爾通過外源性凋亡途徑使血管內皮細胞發生凋亡的效應并不顯著。這一點與血管瘤自身消退機制有所不同。

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Effect of propranolol on the expression of growth factors and apoptotic factors related to infantile hemangiomas

LI Ming, GUO Zhi-hui*, XIE Yi-de, ZHOU Ya-kuan, CHEN Xiao-song, JIANG Cheng-hong, ZHAN Ming-kun, WANG Li-min
Plastic Surgery Department, Union Hospital Affiliated to Fujian Medical University, Fuzhou 350001, China

*Corresponding author, E-mail: guokex@tom.com

This work was supported by the Fujian Medical Innovative Foundation (2012-CX-17), and the Provincial University Project Funded by Fujian Education Department (JK2012020)

ObjectiveTo investigate the effects of propranolol on the expression of growth factors and apoptotic factors related to infantile hemangiomas, and explore the underlying mechanisms for treatment of hemangiomas by propranolol.MethodsOral propranolol was administered to 39 patients ≤3 months with hemangiomas during the proliferative phase, and they were in accordance with the inclusion criteria of the treatment. Patients who had contraindications to treatment were excluded, and informed consent from their family members was obtained. Biopsy of the lesion under local anesthesia was done before medication. The oral dose of propranolol was 1mg/kg per 12 hours. After 8 weeks of treatment, the hemangioma was resected. The specimens taken before and after treatment were scrutinized for changes in tissue structure and cell form after HE staining. The expressions of the proteins ADRB1, ADRB2, ERK, Akt, NF-κB, VEGFA, Cyclin D1, Cyclin E1, Ki-67, Bax, Bcl-2, caspase-8, Fas, FasL, caspase-9, and caspase-3 in the focal tissue were determined with immunohistochemistry and real-time fluorescence quantitative RT-PCR. At the same time, the microvessel density (MVD) value, Ki-67 index and apoptosis index before and after treatment were also determined and compared using CD34, Ki-67 and TUNEL staining technique, respectively. Meanwhile, the mRNA expressions ofthese factors were assessed with quantitative real-time RT-PCR.ResultsAfter 8 weeks of treatment, all the protein content and mRNA expressions of ADRB1, ADRB2, ERK, Akt, NF-κB, VEGFA, Cyclin D1, Cyclin E1, Ki-67, Bcl-2, and MVD value and Ki-67 index were decreased significantly (P<0.01), while the protein and mRNA expressions of Bax, caspase-3, caspase-9, and apoptosis index were increased significantly (P<0.01). However, there was no obvious change in the expressions of Fas, FasL and caspase-8 after treatment.ConclusionPropranolol can inhibit proliferation and promot intrinsic apoptotic pathway of hemangioma through regulating the MAPKs and PI3K-Akt pathways, but it shows no influence on the extrinsic apoptotic pathway.

propranolol; hemangiomas; angiogenic proteins; apoptosis inducing factor

R732.2

A

0577-7402(2015)02-0121-07

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.02.07

2014-07-13；

2014-12-22)

(責任編輯：胡全兵)

福建省醫學創新課題(2012-CX-17)；福建省教育廳資助省屬高校項目(JK2012020)

李銘，醫學碩士。主要從事血管瘤與血管畸形的基礎與臨床研究

350001 福州 福建醫科大學附屬協和醫院整形外科(李銘、郭志輝、謝義德、周亞寬、陳小松、江成鴻、詹明坤、王立敏)

郭志輝，E-mail：guokex@tom.com