DKK1蛋白表達與食管鱗癌臨床病理特征及預后的關系

吳紅波，柳家榮，吳慧娟，趙秀麗，陳麗娟，穆曉倩，胡秀峰，鄒宏志，趙艷秋

DKK1蛋白表達與食管鱗癌臨床病理特征及預后的關系

吳紅波，柳家榮，吳慧娟，趙秀麗，陳麗娟，穆曉倩，胡秀峰，鄒宏志，趙艷秋

目的 探討DKK1在食管鱗癌組織中的表達及其與食管鱗癌臨床病理特征和預后的關系。方法 收集2007 年3月－2009年6月鄭州大學附屬腫瘤醫院150例食管鱗癌組織(實驗組)及52例切緣正常食管組織(對照組)標本，采用免疫組織化學法檢測組織標本DKK1蛋白的表達情況。分析DKK1表達與食管鱗癌患者各臨床病理參數及預后的關系。結果 150例食管鱗癌組織中的DKK1陽性表達105例，陽性表達率為70%，52例正常食管組織中DKK1的表達均為陰性。DKK1表達與腫瘤的浸潤深度和淋巴結轉移相關，與其他臨床病理參數無關；DKK1表達陽性組與陰性組3年生存率(分別為37.1%和53.3%)、5年生存率(分別為14.3%和46.7%)差異均有統計學意義(P=0.008、P<0.001)。單因素分析結果顯示，DKK1表達、淋巴結轉移(pN)及腫瘤浸潤深度(pT)與食管鱗癌患者5年生存率有關；多因素分析結果顯示，DKK1表達、pN、組織分化程度及pT是影響食管鱗癌患者根治術后預后的獨立預測因素(P<0.05)。結論 DKK1在食管鱗癌組織中高表達與食管鱗癌組織的浸潤、轉移能力有關。DKK1可以作為預測食管鱗癌患者不良預后的分子標記物。

基因，DKK1；食管腫瘤；免疫組織化學；預后

食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是我國食管癌的常見組織類型，約占食管癌總發病率的90%。目前，食管癌患者的5年生存率僅為15%～30%，中位生存期約18個月，我國食管癌的發病率仍保持在100/10萬以上的較高水平。目前公認的影響食管癌預后的主要因素有病理類型、TNM分期、治療模式的選擇和患者一般狀況等方面[1]，但由于地域、個體差異及腫瘤的異質性，僅通過上述因素去判斷、評估ESCC患者的預后，選擇治療方案是遠遠不夠的。因此，近年來檢測ESCC患者分子標記物的表達情況，探尋其與ESCC發生、發展及預后的關系[2-5]，成為提高ESCC總體診治水平的重要課題。

Dickkopf-1(DKK1)基因是一種編碼抑制Wnt/ β-catenin信號傳導途徑的分泌性糖蛋白；DKK1在乳腺癌、前列腺癌及肝癌中的高表達與預后密切相關[6-8]；研究表明DKK1蛋白在食管癌組織中呈高表達，并且在4個食管癌細胞系中均有表達，在EC9706細胞中過表達DKK1后能夠促進細胞由G0/G1期向S期轉變，同時能夠增強細胞的侵襲能力[9-10]，但目前相關的臨床研究報道較少。本研究通過檢測中國河南地區食管鱗癌根治性手術術后病理標本DKK1的表達，初步探討DKK1在ESCC的發生、發展、侵襲和轉移中的作用以及DKK1與ESCC患者的預后關系，以期為ESCC的預后判斷及個體化治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 標本選擇 收集河南省腫瘤醫院2007年3月－2009年6月收治的食管癌患者基本資料。按入選標準從中篩選根治術后病理證實為ESCC的150例患者的食管鱗癌組織作為實驗組，以HE染色病理證實為手術切緣正常食管上皮組織的52例患者作為對照組。入選標準：①食管癌根治術后病理診斷為ESCC的患者；②術后病理分期為0－Ⅲ期；③手術為經左或經右側開胸，包括經左頸、主動脈弓上或主動脈弓下吻合，常規胸、腹二野清掃淋巴結；④無其他部位原發腫瘤。排除標準：①臨床、病理及隨訪資料不完整；②手術前已行放化療的患者；③圍術期死亡病例；④隨訪期間已死亡患者且死亡原因不明確病例。

150例患者中，男93例，女57例；年齡41～76歲，中位年齡60歲，其中≤60歲76例，>60歲74例。所有患者根據AJCC 2002版術后病理分期標準pTNM進行分期，其中0－Ⅱ期83例(TisN0M、T1N0M0、T2-3N0M0、T1-2N1M0)，Ⅲ期(T3N1M0、T4任何NM0)患者67例；術后病理分期腫瘤浸潤深度pT1-2者63例，pT3-4期者87例；術后病理分期中無淋巴結轉移者N072例，有淋巴結轉移者N178例；組織高分化者48例，中低分化者102例；術后接受過輔助放化療者48例，未接受輔助放化療者102例。

1.2 免疫組織化學檢測食管癌DKK1的表達 食管癌石蠟切片抗原熱修復后，采用免疫組織化學SP法按照說明書進行操作，用PBS代替一抗作陰性對照，已知陽性片作為陽性對照。DKK1一抗(H-120，美國Santa Cruz公司)，兔抗人多克隆抗體(SC-25516)、通用型SP免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒為北京中杉金橋生物技術公司產品。染色結果根據陽性細胞染色強度及陽性細胞百分數進行分級[11]。由2名病理科醫生采用雙盲原則評定。染色DKK1在胞膜或胞質中表達，每張切片檢測10個高倍視野，按視野中顯色細胞的比例判定，顯色細胞數>10%即為陽性，反之為陰性。

1.3 患者臨床資料收集及隨訪 設計食管癌患者隨訪表。一般資料包括患者住院號、姓名、性別、年齡、聯系電話等；隨訪方式包括電話隨訪、書信隨訪及上門隨訪3種形式，記錄病情提供者身份，以考察隨訪信息是否可靠；出院后治療情況；是否復發，復發后治療情況；患者目前的生存情況。如患者已死亡，記錄死亡時間及原因；終止隨訪，如存活則評價患者目前狀態。入選病例隨訪至患者死亡或手術后5年。患者術后生存時間定義為自手術當日至術后滿5年，如術后5年內死亡，則按自手術當日至死亡日期截止。

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件包進行數據分析。DKK1表達與各臨床病理參數之間的關系采用χ2檢驗，DKK1表達陽性組與陰性組生存分析采用Kaplan-Meier法，組間比較采用Log-rank檢驗，術后5年生存率單因素分析及多因素預后分析采用Cox比例風險模型。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 DKK1蛋白在食管鱗癌及正常鱗狀上皮組織中的表達 DKK1蛋白表達產物主要集中在腫瘤細胞胞質中，亦有部分在胞膜表達(圖1)。150例樣本中DKK1陽性表達共105例，陽性表達率70%，52例正常食管組織DKK1表達均為陰性，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 DKK1蛋白表達與食管癌患者臨床病理特征的關系 有淋巴結轉移組DKK1表達陽性62例，陽性表達率為79.5%，無淋巴結轉移組DKK1表達陽性43例，陽性表達率為59.7%，差異有統計學意義(P=0.008)。腫瘤浸潤深度pT3-4組DKK1表達陽性75例，陽性表達率為86.2%，pT1-2組DKK1表達陽性30例，陽性表達率為47.6%，差異有統計學意義(P<0.001)。DKK1表達與年齡、性別、組織分化程度及病理分期無關(表1)。

圖1 食管鱗狀細胞癌及鱗狀上皮組織中DKK1蛋白的表達(免疫組化染色，DAB)Fig.1 DKK1 protein expression in ESCC and squamous epithelial tissue (Immunohistochemically staining, DAB)

表1 患者的一般臨床資料Tab.1 Clinical features of patients

2.3 DKK1蛋白表達與食管癌患者預后的關系Kaplan-Meier 3年生存分析顯示，105例DKK1表達陽性的患者中，死亡66例，3年生存率為37.1%；45例陰性表達的患者中，死亡21例，患者3年生存率為53.3%；Log-rank比較3年總體生存時間差異有統計學意義(P=0.008)。Kaplan-Meier 5年生存分析顯示，DKK1陽性組與陰性組5年生存率分別為14.3% 和46.7%，DKK1蛋白表達陽性組與陰性組中位生存期時間分別為36個月和54個月，差異均有統計學意義(P<0.001，圖2)。

圖2 不同DKK1蛋白表達食管鱗癌患者的生存曲線Fig.2 Kaplan-Meier survival curves of ESCC patients with different DKK1 expression

2.4 5年生存率與食管癌預后的單因素及多因素分析 單因素生存分析結果顯示，腫瘤浸潤深度pT(HR=2.587，95%CI 1.733～3.861，P<0.001)、淋巴結轉移pN(HR=2.671，95%CI 1.806～3.949，P<0.001)以及DKK1表達(HR=2.550，95%CI 1.621～4.011，P<0.001)與5年生存率明顯相關，而其他病理參數如性別、年齡等與5年生存率無關(表2)。將腫瘤浸潤深度pT、淋巴結轉移pN、DKK1表達(分為陽性組和陰性組)三項因素引入Cox模型進行多因素生存分析，結果顯示：腫瘤浸潤較深pT3-4、有淋巴結轉移及DKK1陽性表達是影響食管癌根治術后患者預后的獨立因素(表3)。

表2 食管鱗癌患者5年生存率影響因素的單因素分析Tab.2 Univariate analyses for 5-years overall survival of ESCC

表3 食管鱗癌患者5年生存率影響因素的Cox比例風險模型分析Tab.3 Multivariate analyses for 5-years overall survival of ESCC patients by Cox regression model

3 討 論

DKK1作為Wnt/β-catenin信號通路的拮抗劑，在許多腫瘤發生、發展過程中起重要作用[12]。DKK1是一種分泌性糖蛋白，可與細胞膜上Wnt受體LRP5和DKK1共受體Kremen1結合，形成內吞小體，從而阻斷Wnt信號通路。

D K K 1在不同腫瘤中的表達水平不一。Gonzalez-Sancho等[13]研究發現，結腸癌組織與正常組織相比DKK1呈低表達，Aguilera[14]、Kuphal等[15]研究發現DKK1在惡性黑色素瘤中的表達也是降低的，證實DKK1是通過Wnt信號通路發揮抑制腫瘤的作用。然而在其他很多惡性腫瘤(包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、Wilms'瘤、多發性骨髓瘤等)的研究中卻發現DKK1為高表達：Wirths等[16]通過消減抑制雜交發現DKK1在人肝母細胞瘤和Wilms'瘤中高表達，在2例肝細胞癌標本中也發現DKK1高表達；Patil等[17]使用DNA微陣列芯片研究肝細胞癌的基因表達模式，也發現DKK1高表達；Forget 等[18]發現DKK1在激素抵抗型乳腺癌細胞(雌二醇激素受體陰性、黃體酮激素受體陰性的乳腺癌細胞)內呈高表達狀態；Qian等[19]發現DKK1在多發性骨髓瘤患者的骨髓瘤細胞中高表達。本研究中，實驗組150例ESCC組織中有105例DKK1蛋白呈陽性，DKK1陽性表達率達70%(105/150)，而對照組52例正常食管切緣組織中DKK1蛋白全部呈陰性表達，兩組的DKK1陽性表達率差異有統計學意義，表明在ESCC中DKK1是高表達的。綜合上述研究及本研究結果證實，DKK1在不同惡性腫瘤中的表達情況及功能作用存在很大差異。DKK1在人類某些腫瘤中可能扮演Wnt抑制劑的角色，但在某些腫瘤中DKK1可能通過另外未知的途徑發揮作用。

本研究在分析150例ESCC患者DKK1表達與臨床病理特征關系時發現，有淋巴結轉移組DKK1表達陽性62例，陽性表達率為79.4%，無淋巴結轉移組DKK1表達陽性43例，陽性表達率為59%，差異有統計學意義(P=0.008)。病理分期pT3-4組DKK1表達陽性75例，陽性表達率為86.2%，病理分期pT1-2組DKK1表達陽性30例，陽性表達率為47.6%，差異有統計學意義(P≤0.001)。DKK1表達與年齡、性別、組織分化程度等臨床病理參數無關。腫瘤細胞的浸潤深度及有無淋巴結轉移很大程度上提示了該腫瘤的侵襲、轉移能力，故本研究結果提示DKK1可能參與了食管鱗癌的發生和發展過程，并增強ESCC的浸潤、轉移能力，促進癌細胞轉移，是食管鱗癌發生、發展中重要的分子事件。DKK1 在ESCC中的高表達可能預示ESCC的侵襲、轉移能力較強，并進一步預示患者預后不良。日本學者Makino等[20]研究發現DKK1表達與任何臨床病理參數均無相關性，這是否與研究樣本的臨床病理特征差異或地域差異所帶來的腫瘤異質性有關，仍有待于進一步加大樣本研究證實。

Kaplan-Meier生存分析顯示，DKK1表達陽性組與陰性組3年生存率分別為37.1%和53.3%，5年生存率分別為14.3%和46.7%，差異均具有統計學意義。單因素分析發現，腫瘤浸潤深度pT、淋巴結轉移pN及DKK1表達與ESCC患者5年生存率相關。將腫瘤浸潤深度pT、淋巴結轉移pN、DKK1表達(分為陽性組和陰性組)三項因素引入Cox模型進行多因素生存分析，結果顯示：腫瘤浸潤較深pT3-4、有淋巴結轉移及DKK1陽性表達是影響食管癌根治術后患者不良預后的獨立因素。以上結果與日本學者Yamabuki等[10]、Mikheev等[21]的研究部分一致。這些結果表明與DKK1表達陰性的ESCC患者相比，DKK1表達陽性的ESCC患者生存期短、預后差，因此DKK1有望成為判斷ESCC不良預后的新的分子標記物。

綜上所述，DKK1在食管鱗癌組織中高表達與食管鱗癌的浸潤、轉移能力有關。DKK1可以作為預測食管鱗癌患者不良預后的分子標記物。但本研究為回顧性研究，證據的論證強度有限，有待大樣本前瞻性隨機對照臨床研究進一步證實。

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Relationship between the DKK1 expression and clinicopathological features and prognosis of oesophageal squamous cell carcinoma

WU Hong-bo, LIU Jia-rong, WU Hui-juan, ZHAO Xiu-li, CHEN Li-juan, MU Xiao-qian, HU Xiu-feng, ZOU Hong-zhi, ZHAO Yan-qiu*
Department of Internal Medicine, Henan Cancer Hospital, Affiliated to Zhengzhou University, Zhengzhou 450008, China
*

, E-mail: 13938252350@163.com
This work was supported by the Health Science and Technology Key Projects of Henan Province (200902007), and the Science and Technology Research Projects of Henan Province (142102310437)

ObjectiveTo investigate the expression of DKK1 in the tissues of esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) and its relation with the clinicopathological features and prognosis of ESCC.MethodsThe expression of DKK1 were assessed by immunohistochemistry (IHC, SP) in 150 cases of ESCC specimens (collected by the authors from Mar. 2007 to Jun. 2009, experimental group), and 52 specimens of normal esophageal tissue adjacent to the tumor (control group). The relationship between the DKK1 expression and the clinicopathological parameters and prognosis of ESCC patients was analyzed.ResultsIn 150 specimens of ESCC tissues, the positive DKK1 expression was found in 105 specimens, and the positive rate was 70%. No DKK1 expression was detected in 52 cases of normal esophageal tissue. High DKK1 expression was correlated with the depth of tumor invasion and lymph node metastasis, but no correlation with other clinicopathological parameters was found. The 3-year survival rate in positive group and negative group of DKK1 expression was 37.1% and 53.3%, respectively (P=0.008), and the 5-year survival rate was 14.3% and 46.7%, respectively (P<0.001). Univariate analysis revealed that the 5-year survival rate was correlated with DKK1 expression, lymph node metastasis (pN), and the depth of tumor invasion (pT) in ESCC. Multivariate analysis showed that the advanced pT stage (T3-4), degree of differentiation, lymphatic invasion, and DKK1 expression were the independent and significant prognostic factors (P<0.05).ConclusionsHigh expression of DKK1 in ESCC tissues is correlated with the degree of cancer invasion, and its potential of metastasis. DKK1, as a molecular marker, may predict a poor prognosis in patients with ESCC.

genes, dickkopf-1; esophageal neoplasms; immunohistochemistry; prognosis

R735.1

A

0577-7402(2015)06-0467-05

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.06.09

2014-10-21；

2015-02-23)

(責任編輯：張小利)

河南省衛生廳醫學科技攻關重點項目(200902007)；河南省科技廳重點科技攻關項目(142102310437)

吳紅波，醫學碩士，主治醫師。主要從事惡性腫瘤生物治療的基礎及臨床應用方面的研究

450008 鄭州 鄭州大學附屬腫瘤醫院內科(吳紅波、柳家榮、吳慧娟、趙秀麗、陳麗娟、穆曉倩、胡秀峰、鄒宏志、趙艷秋)

趙艷秋，E-mail：13938252350@163.com