銅尾礦恢復植物白三葉抗葉斑病反應中防御酶活性變化

李 晶，查美玲，汪徐春

(1.蚌埠醫學院 生物科學系，安徽 蚌埠 233030；2.安徽師范大學 生命科學學院，安徽 蕪湖 241000)

【現代應用技術研究】

銅尾礦恢復植物白三葉抗葉斑病反應中防御酶活性變化

李 晶1,2，查美玲1，汪徐春1

(1.蚌埠醫學院 生物科學系，安徽 蚌埠 233030；2.安徽師范大學 生命科學學院，安徽 蕪湖 241000)

通過盆栽實驗研究了鏈格孢菌對銅尾礦復墾植物白三葉草的致病力及葉片抗病性相關酶活性的影響.結果表明，鏈格孢菌對源自銅尾礦區的白三葉草有一定的致病力但感病指數不高.與不接種對照組相比，接種組葉片的多酚氧化酶、過氧化物酶及苯丙氨酸解氨酶活性升高，差異性顯著.隨著染病時間延長，三種防御酶活性均是先升高后降低.多酚氧化酶活性在接種5天達到高峰，過氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶活性均在接種7天達到最高峰.

復墾植物；抗病性；酶活性

自然界中，病原菌與寄主植物的相互作用一直廣泛存在著，并是研究的熱點之一.研究表明，病原菌感染寄主植物以后，植物個體的生長、組織結構、生理生化特性等方面均會發生變化，比如生長緩慢、葉片變黃、一些次生產物(如植保素)合成、植物細胞壁加強或修飾(如木質素累積)以及一些與抗病性相關的酶活性發生顯著變化等.在植物體內，多酚氧化酶、過氧化物酶以及苯丙氨酸解氨酶是與抵抗病原微生物侵染相關的防御酶[1]，其活性水平可作為植物抗病性的生理指標.[2-5]

安徽銅陵銅尾礦場的復墾植物中，豆科的白三葉草(Trifoliumrepens)為優勢種之一.[6]野外調查發現，作為復墾植物的白三葉草種群中有葉斑病發生，經采樣分離鑒定病原菌為鏈格孢菌 (Alternariatenuis).有研究結果表明，在環境壓力下，病原菌對植物的傷害程度加重[7-8]，然而銅尾礦生長的白三葉草雖有葉斑病發生，仍能生長，并未受到致命性傷害.為探討重金屬污染土壤上生長的白三葉草對葉斑病抗病能力、鏈格孢菌對白三葉草的致病力以及葉斑病是否影響到白三葉草對銅尾礦的復墾作用這些問題，本文選取銅尾礦復墾植物白三葉草進行接種鏈格孢菌實驗，研究病原菌對白三葉草致病力以及植物受病原菌侵染后葉片抗病性防御酶變化規律.為研究白三葉草對鏈格孢菌的防病戰略、抗性機制提供依據，同時為重金屬尾礦區復墾植物抗病遺傳育種提供參考.

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試植物

寄主植物白三葉取自健康、長勢好的同一個無性系，來源地為銅陵獅子山尾礦地，采樣選取生物量、株高基本相同的植物幼苗.實驗前剪取3葉期、長4cm匍匐莖盆栽培養40天后接種.

1.1.2 供試菌種

病原菌為鏈格孢菌，從上述樣地染病白三葉葉片病斑上分離純化而得.

1.1.3 供試土壤

以蚌埠醫學院周邊農田土為供試土壤，土壤pH為7.28，有機質含量為13.90g/kg，總氮、總磷、總鉀含量分別為0.51g/kg、3.67g/kg、3.36g/kg，電導率為136.52μs/cm.

1.2 實驗設計

供試土壤風干后過2mm篩，每盆稱重2kg土壤裝進花盆，共10盆.將剪取的上述長4cm的白三葉匍匐莖種入花盆，每盆10株，培養40天.接種鏈格孢菌分生孢子懸浮液到3葉期植物葉片，方法采用針刺法，同時接種無菌水作對照[9].接種后用塑料袋將接種葉片套袋保濕24 小時.分別隔離培養，并分別于接種前(0天),接種后3天、5天、7天和9天取樣，測定各指標變化情況，重復3次.

1.3 測試指標和方法

1.3.1 鏈格孢菌對白三葉的致病力測定

接種后按表現型記載標準分4級，計算感病指數(見表1)[10].

表1 白三葉草葉斑病分級標準

1.3.2 多酚氧化酶活性測定

采用比色法[11]，以每分鐘內OD410值變化0.01為一個酶活性單位(U/gFW·min).

1.3.3 過氧化物酶活性測定

以1g植物在1min內氧化愈創木酚的微克數為一個酶活性單位[12](U/gFW·min).

1.3.4 苯丙氨酸解氨酶活性測定

以1g鮮重每小時OD290值變化0.01為一個酶活性單位[13](U/gFW·h).

2 結果與分析

2.1 鏈格孢菌對白三葉的致病力測定

由表2可知，接種無菌水對照組的植物感病指數為0，而鏈格孢菌處理組的感病指數均大于0，證明供試鏈格孢菌菌株對白三葉有一定的致病力.但染病指數隨著接種時間變化不明顯，并且接種9天后染病指數剛超過50%，這表明，鏈格孢菌雖然可以侵染白三葉，但是不對其生長造成致命性傷害，這與野外調查發現銅尾礦復墾植物白三葉雖然受到病原菌侵染，但仍能正常生長的結果一致.說明銅尾礦區白三葉有良好的抵抗鏈格孢菌的能力.

表2 鏈格孢菌對白三葉的感病指數

2.2 鏈格孢菌對白三葉多酚氧化酶活性的影響

如圖1，未接種組白三葉葉片多酚氧化酶活性在實驗期略有變化但不明顯，接種鏈格孢菌后，白三葉的多酚氧化酶活性有明顯增加，3 天后明顯升高，到第5 天為最大值，為不接種對照的2.92倍，兩者之間呈極顯著差異，p值小于0.01，隨后酶活性下降的趨勢相對緩慢.

圖1 鏈格孢菌對白三葉葉片多酚氧化酶活性的影響

圖2 鏈格孢菌對白三葉葉片過氧化物酶活性的影響

2.3 鏈格孢菌對白三葉過氧化物酶活性的影響

從圖2可以看出，與對照組相比，接種鏈格孢菌后，白三葉葉片的過氧化物酶活性都顯著增加，接種3天、5天活性升高速度較快，幅度較大，之后活性仍繼續升高，但速度較緩慢，到第7天達到最高峰，是接種之前的2.14倍，隨后略下降.接種第9天，過氧化物酶活性是未接種組的1.83倍.

圖3 鏈格孢菌對白三葉葉片苯丙氨酸解氨酶活性的影響

2.4 鏈格孢菌對白三葉苯丙氨酸解氨酶活性的影響

如圖3，在整個實驗周期內，沒有染病組的白三葉葉片中，苯丙氨酸解氨酶活性相對平穩，沒有顯著差異.而在受到鏈格孢菌感染以后，接種組的苯丙氨酸解氨酶活性迅速增加，到第7天達峰值，較對照組增加了175%，隨后下降，第9天仍高于對照組111%.

3 討論

感病指數可以反映病原菌對寄主植物的致病力.實驗中，接種鏈格孢菌處理組的感病指數均大于0，證明供試鏈格孢菌菌株對白三葉有一定的致病力.一般來說，感病指數隨著患病時間延長會增加，但是本實驗中整個感病期變化不明顯，接種9天后感病指數剛超過50%，這表明：鏈格孢菌雖然可以侵染白三葉，但并不對其生長造成致命性影響，這與野外調查發現銅尾礦復墾植物白三葉雖然受到病原菌侵染，仍能正常生長的結果一致，因此，來源于銅尾礦區白三葉有著良好的抵抗鏈格孢菌葉斑病的能力.

植物體內，酚類氧化物和木質素的形成可以增強植物細胞壁、形成保護屏障，以抵御病原微生物傷害，醌類及衍生物對病原微生物毒性強，能直接產生抗病作用[14].多酚氧化酶，不僅是在一些酚類氧化物和木質素的產生過程中起到催化作用的酶類，還能進一步氧化酚類物質成醌類,大量研究表明，病原菌感染可引起植物體內多酚氧化酶活性升高[15-17].本實驗結果顯示，在受到病原菌感染后，接種組的葉片多酚氧化酶活性在開始時增加迅速，且增加數值大，接種后5天內快速增加到最大值后開始緩慢下降.這種變化揭示，白三葉在鏈格孢菌感染后，多酚氧化酶活性快速增加，使得抵抗病原菌的酚類物質、木質素和醌類物質快速大量產生，從而可以通過增加機械屏障直接產生毒害作用來阻擋入侵的病原菌的傷害與擴散,寄主植物表現出對葉斑病的抗病性.

本實驗結果顯示，感染鏈格孢菌的實驗組中，白三葉草葉片的過氧化物酶活性較不接種組增加.試驗周期內，染病天數增加，酶活性也隨之增加.過氧化物酶在植物體內，對于合成植保素、木質素和氧化酚類物質的過程中起重要作用，同時，它也是植物體內的活性氧清除劑[17].因為植物在受到病原微生物感染后，體內可以形成大量活性氧，而過氧化物酶增加可以幫助清除這些活性氧，從而保護植物免受其傷害.同時，過氧化物酶活性增加后，還能直接促進植保素、木質素合成過程，抵抗鏈格孢菌侵染和擴散，增加抗病能力.

在植物抗病反應中，苯丙烷類代謝可形成植保素、木質素和酚類化合物等多種抗病次生物質，是重要的代謝途徑，而苯丙氨酸解氨酶是這一途徑的關鍵酶和限速酶，受多種因素(病原物侵染、旱、冷及其他逆境等)誘導調控[3].許多研究表明，植物受病原菌侵染后，苯丙氨酸解氨酶活性會升高[4,18-20].實驗結果顯示，鏈格孢菌侵染后，白三葉草葉片苯丙氨酸解氨酶活性顯著增加，表明植物體快速開啟一系列苯丙烷類的反應，加速植保素和木質素大量合成來抵御病菌，表現出抗病性.

病原菌侵染后植物葉片防御酶活性與抗病性關系的報道大多認為，多酚氧化酶、過氧化物酶以及苯丙氨酸解氨酶這三種酶在植物受病原菌侵染后活性升高，并與抗病性成正相關，可以將其作為衡量植株抗病性生理指標[18-20].本實驗結果顯示，接種后多酚氧化酶、過氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶三種酶活性均升高，出現的高峰時間略有不同，多酚氧化酶的高峰出現在第5天，過氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶均在第7天出現高峰.因此，在白三葉感染鏈格孢菌后，不能簡單地認為上述三種酶在任何發病時期都可以作為抗病性指標，還要綜合考慮發病的時間來確定.

綜上，鏈格孢菌對白三葉有一定的致病力，侵染后使白三葉體內與抗病相關的酶如多酚氧化酶、過氧化物酶以及苯丙氨酸解氨酶三種酶活性升高，促使了木質素、植保素等保護性物質的合成，提高了白三葉對鏈格孢菌的抗病性.

[1] Ahl-Goy,P Felix,G Metraux,et al.Resistance to disease in the hybrid Nicotiana glutinosa×Nicotiana debneyi mediated by peroxidase and polyphenol oxidase[J].Physiology and Molecular Plant Pathology，1992，41:11-21.

[2] 楊建卿，許大鳳，孔俊，等.2005不同煙草品種罹黑脛病后幾種酶活性的變化[J].合肥工業大學學報(自然科學版)，2005，28(7)：816-819.

[3] 鄒芳斌，司龍亭，李新，等.黃瓜枯萎病抗性與防御系統幾種酶活性關系的研究[J].華北農學通報，2008,23(3):181-184.

[4] 富饒，陳志霞，周寶利，等.月桂酸對番茄葉霉病及番茄抗性生理指標的影響[J].沈陽農業大學學報，2013,44(4)：418-422.

[5] 林玲,盧江，黃羽，等.不同葡萄品種感染霜霉病菌后葉片中幾種酶活性的變化[J].南方農業學報，2014，45(2):222-225.

[6] Wang Y B,Liu D Y,Zhang L,et al.Patterns of vegetation succession in the process of ecological restoration on the deserted land of Shizishan copper tailings in Tongling city[J].Acta Botanica Sinica(in English)，2004，46(7):780-787.

[7] Burdon J J.Diseases and plant population biology[M].Cambridge：Cambridge University Press，1987.

[8] Thrall P H，Burdon J J，Young A.Variation in resistance and virulence among demes of a plant host-pathogen metapopulation.[J].Journal of Ecology,2001,89(5):736-748.

[9] 劉登義，李晶，王興明，等.銅脅迫下鏈格孢菌對白車軸草生理生化特性的影響[J].生態學報，2006,26(5):1397-1404.

[10] 方中達.植病研究方法[M].第4版.北京:中國農業出版社，1998.

[11] 李忠光，龔明.植物多酚氧化酶活性測定方法的改進[J].云南師范大學學報,2005,25(1):44-45.

[12] 波欽諾克.植物生理生化分析方法[M].北京:科學出版社，1981.

[13] 李合生.植物生理生化實驗原理和技術[M].北京：高等教育出版社，2000.

[14] Avdiushko S A,Ye X S,Kuc J.Detection of several enzymatic activities in leaf prints cucumber plant[J].Physiol Mol.Plant Pathol，1993,42:441-454.

[15] 王金生.分子植物病理學[M].北京：中國農業出版社，2001.

[16] 袁慶華，桂枝，張文淑.苜蓿抗感褐斑病品種內超氧化物歧化酶、過氧化物酶和多酚氧化酶活性的比較[J].草業學報，2002，11(2):100-104.

[17] 趙光偉，徐永陽，徐志紅，等.甜瓜白粉病抗性反應中相關防御酶活性變化[J].中國農學通報，2009,25(16):206-209.

[18] 李靖,利容千，袁文靜.黃瓜感染霜霉病菌葉片中一些酶活性的變化[J].植物病理學報,1991,21(4):277-283.

[19] 楊輝，沈火林，朱鑫，等.防御酶活性、木質素和總酚含量與辣椒抗黃瓜花葉病毒的關系[J].中國農學通報，2006,22(5):369-372.

[20] 李明巖，屈淑平，崔崇士.利用酶活性鑒定南瓜對白粉病菌抗病性的研究[J].東北農業大學學報，2007,38(6): 737-741.

【責任編輯 馬小俠】

Changes of Related Defense Enzyme Activity in Resistance to the Leaf Spot Disease of a Reclamation Plant in Copper Tailing

LI Jing1, 2, ZHA Mei-ling1, WANG Xu-chun1

(1. Department of Life Sciences, Bengbu Medical College, Bengbu 233030, China; 2. College of Life Sciences, Anhui Normal University, Wuhu, 241000, China)

Through pot cultivation experiments, the effects ofA.tenuison changes of related defense enzyme activity in resistance to the leaf spot disease of white clover, a reclamation plant in copper tailing, were studied. The results showed thatA.tenuishas some virulence to white clover but susceptible index is not high. Compared with the non-inoculated control group, polyphenol oxidases, peroxidase and phenylalanin ammonia-lyase activity of white clover leaves in inoculated group significantly increased. With prolonged illness, activity of the three enzyme and lignin content firstly increased and then decreased. Polyphenol oxidase activity peaked at 5 d, peroxidase and phenylalanin ammonia-lyase activity were reached the peak at 7 d.

reclamation plant; resistance; enzyme activities

2014-04-13

安徽高校省級自然科學研究項目：安徽銅陵藥用植物鳳丹種植區土壤及藥材中重金屬含量及其健康風險初步評價(KJ2013Z208)；蚌埠醫學院科研項目：重金屬銅污染土壤復墾植物白三葉草的抗病性機制研究(Byky1207)

李晶(1981—)，女，江蘇揚州人，蚌埠醫學院生物科學系講師，安徽師范大學生命科學學院博士研究生，主要從事生態學和天然藥物研究.

S

A

1009-5128(2015)10-0030-05