辣椒花藥培養再生植株的倍性鑒定

付文婷，何建文，楊 紅，邢 丹，張愛民，蘇 丹，韓世玉

（貴州省辣椒研究所，貴州 貴陽550006）

在辣椒單倍體育種中，通過辣椒花藥培養出的再生植株，往往是染色體倍性水平不同的混合群體[1－3]，早期的倍性鑒定是構建DH 群體十分重要的技術環節[4]，所以有效的倍性鑒定關系到單倍體的育種進程，也是了解其遺傳背景和進一步應用的基礎。傳統的倍性鑒定方法有染色體壓片計數法[5]、觀察開花結實情況[6]和葉片氣孔保衛細胞的大小及其葉綠體數目的測定進行倍性判斷[7－9]，前者程序復雜耗時多，但準確性高；中間者的鑒定時期太晚，導致單倍體材料無法收種，浪費育種材料；后兩者易受操作者的經驗影響，導致鑒定結果不同[10]。DNA流式細胞儀測定法通過測量核DNA 含量進行倍性鑒定，該方法具有快速、準確和操作簡便等優點，但檢測費用大，只適宜于小批量的植株倍性檢測[11－12]。不同的倍性鑒定方法會導致不同的鑒定結果。所以尋求一種準確、快捷且有效的方法非常必要，對加速辣椒育種進程也具有重要意義。筆者以自育辣椒為試材，以DNA 流式細胞測定結果為依據，研究染色體壓片技術法結合后期再生植株生長狀況及坐果調查對染色體的倍性構成進行分析，并結合3種方法對倍性準確性進行驗證，從而篩選有價值的材料，對辣椒單倍體育種技術在實踐中的利用具有指導意義。

1 材料與方法

1.1 供試辣椒

供試材料為8024，在貴州省辣椒研究所試驗基地種植。自2012年4月下旬開始，取辣椒材料8024花蕾進行花藥培養，采用MS 培養基，培養方法參考文獻[13]。獲得花藥培養再生植株15 株。再生植株均為2012年5—9月于貴州省辣椒研究所綜合實驗室通過花藥培養獲得。選用8024正常二倍體作為對照材料。

1.2 根尖染色體壓片計數法

分別取8024正常組培苗和8024花藥培養再生植株0.5～1cm 長的根尖，先經過秋水仙素預處理3h，再經卡諾固定液固定24h 后，用清水沖洗3次，再用1mol／L HCl在60℃水浴條件下解離3～5min，最后用卡寶品紅染色制作壓片，在10×40倍顯微鏡（Olympus X71）下觀察根尖染色體并計數，拍照成像。

1.3 DNA流式細胞儀倍性鑒定法

分別取大小1cm 左右的幼苗葉片作為倍性檢測材料。采用BC公司的Cyflow space流式細胞儀進行倍性鑒定。使用Mod Fit軟件進行結果分析。

1）測定步驟。取對照和花培再生植株新鮮葉片大小約1g，分別加入400μL細胞裂解液中，用手術刀片切碎、過濾、收集濾液，經800r／min 離心5 min后，用DAPI染液對細胞核DNA 進行熒光標記，置于暗處30min后，用流體細胞儀進行植株倍性鑒定。上樣后流式細胞儀自動形成代表該樣品倍性的DNA 含量分布圖。

2）倍性鑒定。用已知二倍體8024作對照調試流式細胞儀，使對照的G1 期位于200 道附近（圖1）。每個待測樣本測定1次，G1期的DNA 峰值處于100道、200道、300道和400道附近的分別為單倍體、二倍體、三倍體和四倍體，其余的為非整倍體。

1.4 花培再生植株的形態及坐果情況調查

2012年12月—2013年4月，陸續將15株花培再生植株移栽到花盆中放入塑料大棚，進行田間正常管理。2013年9—11月期間對單株進行采收，記錄正常坐果數。

2 結果與分析

2.1 DNA流式細胞儀檢測再生植株的倍性構成

用DNA流式細胞儀檢測的辣椒花藥培養15株再生單株中，結果顯示單倍體、二倍體、混倍體（同一片葉是由單倍體、二倍體倍性的細胞組成）和非整倍體同時存在（圖1）。單倍體為10 株，二倍體3株，混倍體和非整倍體各1株，各占再生植株總數的66.7%、20%、6.65%和6.65%。倍性在鑒定過程中，DNA 含量分布圖有時會有偏鋒的問題，如G1和G2的峰在200，400道偏右的位置，通過重復檢測，這種現象會消失，這是因為樣本準備時間太長所致[14]。但通過根尖染色體數顯示染色體數為24條，而且坐果也正常，所以此植株為二倍體。

2.2 根尖染色體壓片計數法鑒定倍性構成

根尖壓片染色體計數法觀察到這15株花藥培養再生植株中，單倍體、二倍體和混倍體各為10株、4株和1株，各占再生植株總數的66.7%、26.7%和6.6%。其中，混倍體的情況是同一植株同一根的細胞為單倍體、二倍體2種倍性構成（圖2）。

2.3 DNA流式細胞儀與染色體壓片計數法測定再生植株倍性的差異

從表得出，在15 株單株的測定中，2 種檢測方法10株單倍體，3株二倍體，1株混倍體，共14株得到一致的結果。剩余1株，流式細胞儀測定為非整倍體，而染色體壓片測定為二倍體。2種方法吻合度為93%。

圖1 流式細胞儀測定的辣椒花藥培養再生植株DNA分布Fig.1 DNA distribution in anther culture derived pepper plants in FCM analysis

圖2 單倍體（n＝12）、二倍體（n＝24）和混倍體細胞的染色體Fig.2 Chromosome of haploid cell（n＝12），diploid cell（n＝24）and mixoploid cell

2.4 再生植株移栽后的生長與坐果情況

將15株花藥培養再生植株移栽到花盆中，由于再生植株的生長勢很弱，除了1株非整倍體在移栽后死亡，其余14株都能正常生長，植株移栽后的生長情況與DNA 細胞流式儀檢查結果相一致。

2.4.1 不同倍性再生植株移栽后成株期的田間表現 再生植株移栽后，不同倍性的植株表現差別比較大。單倍體植株矮小，葉片小，但分枝能力很強，達12～18枝／株，遠大于二倍體（5～8 枝／株）。二倍體與其他正常二倍體植株并無差別。混倍體表現與二倍體植株大小也無區別，只是葉片稍大于二倍體，葉色較深。

2.4.2 不同倍性植株花期田間表現 單倍體再生植株花蕾大部分黃化，很容易落花，正常開放的花明顯小于二倍體，花瓣黃白，花瓣開展度與花柱呈45°，花藥遠遠短于柱頭，花藥干癟且無花粉，但隨著花期的延長，開到第四層花時，花藥有少量花粉且有活力；二倍體植株開花習性、花形態特征均與自然生長的二倍體植株無區別，花瓣為白色，花瓣開展度與花柱呈90°；混倍體植株表現為花瓣白色，花藥部分可育，部分不可育（圖3）。

圖3 不同倍性植株移栽后的花器官Fig.3 Floral organ of plants with different ploidy after transplantation

2.4.3 再生植株倍性與再生植株坐果情況的相關性 由表可見，被檢測的15 株再生植株中，除了1株非整倍體在移栽后死亡，成活的14株再生植株中3株二倍體正常結實外，其余的10株單倍體中有8株沒有正常的果實和種子，其余2株結正常果實，但果實比正常二倍體果實小，部分果實結籽，另一部分結假性果實，說明單倍體也有一定的育性[15]。另外1株混倍體（單倍體＋二倍體）有正常的果實和種子。說明，DNA 流式細胞儀和染色體計數的倍性檢測結果與坐果情況一致。

表 花藥培養再生植株倍性與再生植株的坐果情況Table Ploidy level and fructification in regenerated plants

3 結論與討論

試驗中辣椒花藥培養再生植株群體中除了單倍體和二倍體外，尚未發現三倍體和四倍體，可能是檢測再生群體數量比較少，這與張麗等研究一致[16]；但試驗中也出現混倍體和非整倍體的現象，這種現象是植株不同器官的染色體數目構成不一致所致，還是這15株花藥再生植株的染色體結構發生了一定變異導致DNA 甲基化[17]，尚有待進一步研究。研究表明：染色體壓片計數法和DNA 流式細胞儀檢測的結果基本一致。采用染色體壓片計數法在群體不大的情況下還是一種準確可行的方法，能準確反映出染色體數目。此方法雖然簡單易行，但需要熟練的細胞學操作技術，材料處理繁瑣耗時[18]。在試驗中還發現，由于花藥培養再生植株不同器官和組織可能存在混倍性的現象，導致結果不一，所以不能僅憑個別的染色體數目來決定植株的倍性，需要大量壓片結果才能準確的反映出植株倍性情況。

采用細胞流式儀可以對大量的花藥培養再生植株進行倍性鑒定，鑒定結果快速準確[19]，但其樣品準備時間不宜過長，否則會影響鑒定結果[14]。對于不同的作物、不同的取材部位，所用的裂解液配方、操作程序、儀器工作參數都有變化，所以通過試驗找出針對某種作物某一取材部位的最佳流式細胞儀工作條件，建立DNA 流式細胞儀分析體系是今后使用流式細胞儀檢測倍性的工作方向。田間再生植株生長和坐果情況也不能真實反映再生植株的倍性情況，尤其單倍體植株部分雖然結果，但果實沒有結籽（假性果實），與熊秋芳等研究結果一致[20]，所以在試驗條件允許的情況下，可以用染色體壓片計數法結合流式細胞儀鑒定法，后期觀察再生植株結籽情況會更加準確的反映鑒定結果，能更好的將單倍體培養應用到育種實踐中去。

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