山莓莖皮總黃酮的提取及其抗氧化活性

石登紅，蔣華梅，劉 燕，王向前

（1.貴陽學院 生物與環境工程學院，貴州 貴陽550005；2.貴陽學院 化學與材料工程學院，貴州 貴陽550005；3.貴陽學院圖書館，貴州 貴陽550005）

山莓（RubuscorchorifoliusL.F.）又名懸鉤子、三月泡、山拋子、四月泡、刺葫蘆、饅頭菠、高腳菠、泡兒刺，系薔薇科（Rosaceae）懸鉤子屬（Rubus）中的一種落葉灌木[1]，野生資源除我國東北、甘肅、西藏、新疆、青海外，各省均有分布。山莓的根、莖、葉和果實均可入藥，有活血、解毒、止血等功效，是一種民間常用的苗族藥[2]。有關山莓果實的資源利用[3－5]、營養成分分析 等[6]研究已有文獻資料報 道。山莓栽培利用已成為傳統的重要水果[7－8]。但是，目前研究山莓葉的化學成分和藥用價值方面的文獻資料甚少[9－16]，國內外對山莓的研究仍集中在資源利用、葉的藥用及果實食品加工等方面。

懸鉤子屬植物中黃酮類化合物的提取研究已有相關研究報道[17－18]，但是對山莓莖皮黃酮類物質的提取和抗氧化性方面的研究尚未見報道。山莓資源在各地分布廣泛，為深入研究山莓莖皮的藥理活性物質，提高山莓的藥用價值，筆者以貴州野生山莓為試驗材料，利用有機溶劑回流提取法，正交試驗設計，對山莓莖皮中的總黃酮進行提取，并用分光光度法測定總黃酮含量，首次對山莓莖皮黃酮清除ABTS和DPPH自由基能力進行研究，以期為貴州野生山莓莖皮提取物進一步分離純化、抗氧化活性試驗、單體分析等奠定基礎，為挖掘山莓莖皮的藥理作用、充分開發利用山莓資源提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

野生山莓莖皮采自貴州貴陽，采摘時間為3月，以當年生嫩枝為主，分別采集山莓植株的上、中、下部位和四周，共采集20g，100℃恒溫干燥后研碎備用。

試劑為硝酸鋁Al（NO3）3、亞硝酸鈉（NaNO2）、無水乙醇（CH3CH2OH）、氫氧化鈉（NaOH），均為分析純，蘆丁為標準品≥97%（120℃干燥至恒重），ABTS和DPPH 均采自由Sigama公司提供。

儀器：UV－2550型紫外可見分光光度計（日本島津）、電子天平（美國奧豪斯）。

1.2 蘆丁標準溶液的配備

精密稱取蘆丁標準品2.5mg于10mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，濃度為0.25mg／mL。

1.3 測定波長的選擇

采用Al（NO3）3法，參考文獻資料[16，19]精密移取上述蘆丁標準品溶液1 mL 于10 mL 比色管中，稀釋至2.40 mL，加5%亞硝酸鈉0.40 mL，搖勻，6min后加入10% Al（NO3）3水溶液0.40mL，搖勻放置6min，再加4% NaOH 4.00mL，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，靜置15min。以不加NaNO2的溶液為空白，采用紫外－可見分光光度法，在波長400～800nm掃描[16－17]，以最大吸光度的波長為測定波長。

1.4 蘆丁標準曲線的繪制

精密移取蘆丁標準品溶液0.00mL、0.01mL、0.02mL、0.03mL、0.04mL、0.05mL和0.06mL分別置于10 mL 的比色管中，按照1.3 的步驟稀釋，搖勻，最后靜置15min，用紫外－可見分光光度計在506nm 波長下測定上述溶液的吸光度，以吸光度A 為縱坐標，稀釋后各蘆丁標準溶液濃度C 為橫坐標，繪制標準曲線，計算蘆丁標準溶液的回歸方程及相關系數：C＝0.0911×A－0.0025，R2＝0.997 3。

1.5 山莓莖皮總黃酮的測定

準確移取山莓莖皮提取液各0.5mL，按1.3的方法顯色，并測定吸光度，將吸光度值代入蘆丁標準曲線方程求出待測樣品的濃度，根據公式：樣品總黃酮質量（mg）＝濃度×10×100／0.5，總黃酮含量（mg／g）＝樣品總黃酮質量／樣品質量，計算各樣品總黃酮質量和含量。

1.6 不同因素的考察

1.6.1 乙醇濃度 稱取1g的山莓莖皮粉末4份分裝入250mL燒瓶中，分別加入60%、70%、80%、90%的乙醇溶液各30mL，70℃回流提取2h，抽濾，收集濾液，同樣條件下重復提取1次，合并濾液，用相應濃度的乙醇定容到100mL的容量瓶中，按1.5的方法進行總黃酮的測定（下同）。

1.6.2 料液比 稱取1g山莓莖皮粉末4份分裝于250mL 燒瓶中，分別加入料液比（g／mL）為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50的70%乙醇溶液，80℃回流提取2h，抽濾，收集濾液，同樣條件下重復提取1次，合并濾液，定容到100mL的容量瓶中。

1.6.3 回流溫度 稱取1g山莓莖皮粉末4份分裝于250mL燒瓶中，加入70%乙醇溶液各30mL，分別在50℃、60℃、70℃、80℃回流提取2h，抽濾，收集濾液，同樣條件下重復提取1次，合并濾液，定容到100mL的容量瓶中。

1.6.4 提取時間 稱取1g山莓莖皮粉末4份分裝于250mL燒瓶中，加入70%乙醇溶液各30mL，于80℃分別回流提取2h、3h、4h、5h，抽濾，收集濾液，同樣條件下重復提取1次，合并濾液，定容到100mL的容量瓶中。

1.7 山莓莖皮總黃酮提取條件的優化

根據單因素試驗結果，以乙醇濃度（A）、料液比（B）、回流溫度（C）和提取時間（D）為考察因素，以山莓莖皮總黃酮含量為指標，采用L9（34）進行正交試驗，其因素水平見表1。

表1 山莓莖皮總黃酮提取的L9（34）正交試驗因素及水平Table 1 Factors and levels for L9（34）orthogonal test fromR.corchorifolius stem barks

1.8 抗氧化活性試驗

1.8.1 清除ABTS自由基 精密稱取0.096 0g ABTS，蒸餾水溶解、定容至25 mL 容量瓶，濃度7mmol／L，記為試劑1。稱取0.378 4g K2S2O8（過硫酸鉀），蒸餾水溶解、定容至10 mL 容量瓶，濃度140mmol／L，記為試劑2。精密吸取5 mL 試劑1于10mL容量瓶，加入88μL 試劑2，搖勻，避光放置12～16h，即為ABTS儲備液。移取一定體積的ABTS 儲 備 液，用75% 乙 醇 溶 液 稀 釋100 倍，732nm測吸光值在0.7±0.0。按上述1∶100的比例配制ABTS溶液用于清除ABTS自由基試驗。

樣品溶液：吸取正交試驗中總黃酮含量較高的溶液0.5mL，用75%乙醇稀釋至3 mL，即為樣品溶液。

分別取樣品溶液5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、30μL、35μL、40μL、45μL、50μL、55μL、60μL和65μL，用75%乙醇將樣液稀釋至0.5mL，每管中加入0.3mmol／L的ABTS溶液2.5mL，振搖10s以上，避光靜置10min，用75%乙醇作空白對照，于742nm 下測吸光度值，計算清除率。BHT樣品溶液 濃度1.5 mmol／L，分別取BHT 溶液5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、30μL、35μL、40μL、45μL和50μL按上述步驟進行清除ABTS試驗，計算清除率。

式中，A0為空白對照吸光度，A樣為樣品吸光度。根據濃度與清除率求出一元線性方程、相關系數，計算半數清除率IC50值。

1.8.2 清除DPPH 自由基 分別吸取正交試驗總黃酮含量較高的樣品溶液0.02 mL、0.04 mL、0.06mL、0.08 mL、0.10 mL、0.12 mL、0.14 mL、0.16mL和0.18mL于10mL比色管中，用75%乙醇溶液定容至4 mL，振蕩搖勻，分別加入0.3mmol／L的DPPH 溶液4 mL，振蕩搖勻，空白對照為75% 乙醇，常溫避光反應60 min 后于523nm測吸光度值，采用以下公式計算清除率[11]。BHT 樣品溶液濃度7.5 mmol／L，分別取BHT 溶液0.02 mL、0.04 mL、0.06 mL、0.08 mL、0.10mL、0.12mL、0.14mL、0.16mL、0.18mL和0.20mL按上述步驟進行清除DPPH 試驗，計算清除率。

2 結果與分析

2.1 不同因素對山莓莖皮總黃酮含量的影響

由表2可知，不同乙醇濃度、料液比、回流溫度、提取時間對山莓莖皮中總黃酮提取率均有影響。

1）乙醇濃度。隨乙醇濃度升高總黃酮提取率逐漸降低，當乙醇濃度超過90%以后提取率下降最明顯。因此，選擇60%、70%、80%的乙醇濃度作為正交試驗的3個水平。

2）料液比。在同等條件下，料液比與總黃酮提取率成正比，當料液比在1∶20～1∶40時，提取率增加顯著，超過1∶50后提取率增加緩慢?？紤]到實際生產的效益，選擇料液比1∶30、1∶40、1∶50作為正交試驗的3個水平。

3）提取溫度。提取溫度在50～70℃，總黃酮提取率隨溫度的升高而顯著增大，但溫度為80℃時提取率降低。因此，選擇提取溫度60℃、70℃、80℃作為正交試驗的3個水平。

4）提取時間。總黃酮提取率隨提取時間的增加而增大，可見提取時間越長，總黃酮提取越充分，但當時間超過3h時，提取率明顯下降。同樣，考慮實際生產的效益，選擇提取時間2h、3h、4h作為正交試驗的3個水平。

2.2 山莓莖皮正交試驗各處理的總黃酮含量

對山莓莖皮總黃酮提取的正交試驗結果（表3）進行極差分析（表4）可知，極差RA＞RC＞RB＞RD，4個因素對山莓莖皮中總黃酮提取率的影響大小依次為乙醇濃度（A）＞回流溫度（C）＞料液比（B）＞提取時間（D）。4個因素中，乙醇濃度和回流溫度的影響作用最顯著，其次是料液比，影響最小的是提取時間。根據4 個因素的k1、k2和k3值大小可知，A因素A1＞A2＞A3，B因素B1＞B2＞B3，C因素C3＞C1＞C2，D 因素D3＞D2＞D1。因此，乙醇回流提取山莓莖皮總黃酮的最佳工藝條件為A1B1C3D3，即乙醇濃度60%、料液比1∶30、回流溫度80℃、提取時間4h，經驗證試驗得總黃酮提取量為28.811 mg／g。

表2 不同乙醇濃度、料液比、提取溫度和提取時間的山莓莖皮總黃酮含量Table 2 Total flavonoids extracted fromR.corchorifolius stem barks with various ethanol concentration，solid－liquid ratio，extraction temperature and time

表3 山莓莖皮L9（34）正交試驗各處理的總黃酮含量Table 3 Total flavonoids contents of different L9（34）orthogonal test treatments of R.corchorifolius stem barks

表4 山莓莖皮正交試驗各因素水平總黃酮含量的均值與極差Table 4 The average and range of total flavonoids in the stem bark of R.corchorifolius at different conditions

圖示 山莓莖皮黃酮和BHT不同濃度對ABTS和DPPH 自由基的清除率Fig.ABTS and DPPH free radical－savenging rates of flavonoids from the bark of R.corchorifolius and BHT

2.3 山莓莖皮黃酮清除ABTS和DPPH自由基的能力

BHT 是人工合成的抗氧化劑，具有提高產品穩定性和保持品質等效果，但是有對人體造成潛在傷害的弊端[20]。由圖示可見，山莓莖皮黃酮的提取液對ABTS和DPPH 自由基具有明顯的清除效果，清除能力比BHT 高，且隨著質量濃度的增加，清除率也隨著增大，但增加到一定的質量濃度時，清除率增大幅度趨于平緩。在黃酮、BHT 抗氧化劑的質量濃度較低時，2種溶液對ABTS和DPPH 自由基的清除率（y）與質量濃度（x）之間呈近似線性關系（表5）。可見，山莓莖皮黃酮的提取液具較強的抗氧化性，山莓黃酮提取液對ABTS和DPPH 自由基清除率達50%時，IC50值均低于合成抗氧化劑BHT 的IC50值，因此有望成為一種天然抗氧化劑。

表5 清除率與抗氧化劑加入量的線性關系及抗氧化劑IC50值Table 5 Relationship between scavenging rate and antioxidant concentration and IC50of antioxidants

3 結論

1）正交試驗結果表明，乙醇回流提取山莓莖皮總黃酮最佳提取工藝條件為：乙醇濃度60%、料液比1∶30、回流溫度80℃、提取時間4h，在此提取條件下，山莓莖皮中總黃酮的含量可達28.811mg／g。

2）貴州春季野生山莓莖皮中總黃酮的含量高達28.811mg／g，高于文獻報道的山莓葉春季總黃酮含量1.463 7mg／g[16]。說明，黔產野生山莓莖皮蘊含豐富的總黃酮資源。

3）經驗證試驗，山莓莖皮黃酮提取液對ABTS和DPPH 自由基清除率達50%時，IC50值均低于合成抗氧化劑BHT 的IC50值，因此具較好的抗氧化性，有望成為一種天然抗氧化劑，為進一步開發與利用野生山莓資源提供科學依據。

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